Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

212 S.W. Hell
hier nur am Rande bemerkt, dass man prinzipiell 4π-konfokale Mikroskopie
mit beliebiger relativer Phase betreiben kann, es ist nur wichtig, dass man
die relative Phase kennt. Leider kann man nicht erwarten, dass das immer
der Fall ist. Schwankt die Phase aufgrund von starken Brechungsindexvariationen
der Probe, so ist mit einer Phasenunsicherheit zu rechnen, welche
diese Methode empfindlich einschränkt. Ein anderer Nachteil ist, dass bei
Objektiven hoher Apertur der freie Arbeitsabstand zwischen Objektiv und
Deckglas gering ist. Trotzdem hat die 4π-konfokale Mikroskopie ein hohes
Potential, sich als ein leistungsfähiges, höchstauflösendes Fernfeldmikroskop
zu etablieren. Mit Auflösungswerten im Bereich von λ/5–λ/10 kommt sie
der Auflösung der optischen Nahfeldmikroskopie sehr nahe. Im Gegensatz zu
dieser besitzt sie aber die Fähigkeit zur dreidimensionalen Abbildung.
9.3.3 Höchstauflösung in lateraler Richtung: Neuere Konzepte
Spannender als die Auflösungserhöhung in axialer Richtung gestaltet sich die
Auflösungsverbesserung in lateraler Richtung. War man über lange Zeit der
Meinung, dass man aufgrund des Abbe-Beugungskriteriums an eine kaum
zu überwindende Grenze angelangt sei, so lassen sich heute zumindest theoretisch
leistungsfähige Konzepte aufstellen, die eine fundamentale Verbesserung
der Auflösung in Aussicht stellen. Ebenso wie das 4π-konfokale Mikroskop
beruhen sie auf der gezielten Veränderung der effektiven fokalen Ausdehnung
in der Fluoreszenzmikroskopie. Man versucht durch die Kombination
von photophysikalischen Effekten und optischer Anordnung eine räumlich
schmälere effektive PSF zu erzielen. Ein solches Konzept ist das STED-
Fluoreszenzmikroskop (engl. Stimulated Emission Depletion Microscope), mit
dessen Hilfe man die laterale Auflösung eines Fluoreszenzmikroskops theoretisch
bis in den Bereich von 30–50 nm herunterführen kann.
Die Grundidee des STED-Fluoreszenzmikroskops ist, den effektiven Fokus
zu verschmälern, indem die Moleküle im Randbereich des Fokus am Fluoreszieren
gehindert werden. Dies soll dadurch erfolgen, dass man sie kurz
nach der Anregung durch stimulierte Emission in den Grundzustand zwingt.
Registriert man nur das Fluoreszenzlicht aus dem Innenbereich des Fokus,
so ist nur der Teil des Fokus effektiv, in dem die Moleküle nicht in den
Grundzustand gezwungen worden sind. Dabei kann man einen ringförmigen
Laserstrahl benutzen, der auf den geometrischen Fokuspunkt des Anregungsstrahls
zentriert ist. Um eine scharfe Abschneidekante zu erreichen,
muss man allerdings die stimulierte Emission in die Sättigung treiben. Es
sind gepulste Laser mit vergleichsweise hoher Spitzenintensität vonnöten.
Eine weitere Herausforderung ist die Verringerung des Signals aufgrund immer
kleinerer effektiver Foki sowie nicht perfekt scharfen Abschneidekanten
des stimulierenden Strahls. Diesen Herausforderungen kann man prinzipiell
durch ausgesuchte Farbstoffe mit geeigneter Photophysik begegnen.