Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

144 C. Cremer
rale Distanz Dxy,max zugleich die euklidische 3D-Distanz zwischen den beiden
Targets ist. Messungen an Fluoreszenzbeads der gleichen spektralen Signatur
sowie an fluoreszenzmarkierten Chromatinregionen in Zellkernen auf Glasfasern
zeigten, dass mit der axialtomographischen CLSFM grundsätzlich 3D-
Distanzmessungen zwischen den Schwerpunkten der Fluoreszenzintensität
mit einem Fehler bis unter 10 nm möglich sind [10, 11].
Statt das Objekt selbst zu drehen, ist es auch möglich, das Fluoreszenzlicht
gleichzeitig von verschiedenen Seiten aus (konfokal) zu registrieren. Auch
bei dieser Thetamikroskopie genannten Methode ergibt sich eine wesentliche
Auflösungsverbesserung im Vergleich zur konventionellen Mikroskopie mit
gleicher numerischer Apertur [58,92]. Der große Vorteil der Thetamikroskopie
liegt vor allem bei der hochauflösenden, dreidimensionalen konfokalen Fluoreszenzmikroskopie
von vielzelligen, in axialer Richtung bis zu 1 mm ausgedehnten
Objekten.
8.2.3 Fluoreszenzmarkierungstechniken
für die 3D-Mikroskopie des Genoms
Ein für die Genomforschung wirkungsvoller Einsatz der 3D-Mikroskopie im
Allgemeinen und der konfokalen Laserscanningfluoreszenzmikroskopie im Besonderen
ist nur möglich, wenn in der Zelle biochemisch, molekularbiologisch,
oder funktionell charakterisierte Subregionen spezifisch mit einer Fluoreszenzmarkierung
geeigneter spektraler Signatur versehen werden können.
Dies muss in situ erfolgen, d.h. an Ort und Stelle, in dem dreidimensional
soweit als möglich konservierten ( intakten“) biologischen Objekt. Hierzu
”
wurden eine Reihe von In-situ-Markierungsverfahren entwickelt, die auf molekularbiologischen
bzw. immunhistochemischen Grundlagen beruhen.
In-situ-Hybridisierung. Molekularbiologische Verfahren haben es erstmals
möglich gemacht, individuelle chromosomale DNA-Sequenzen im Zellkern direkt
sichtbar zu machen. Diese Visualisierung beruhte auf der Anwendung der
1969 von Gall eingeführten Methode der In-situ-Hybridisierung. Bei diesem
Verfahren werden in der Regel einzelsträngige, markierte DNA- (oder RNA-)
Sequenzen (Proben) an komplementäre, einzelsträngige (denaturierte) chromosomale
DNA-Zielabschnitte (Targets) in situ hybridisiert, d.h. am Ort des
Targets in den Zellen selbst. Die Markierung der Proben erfolgte zunächst
mit Hilfe von Radioisotopen (insbesondere von tritiummarkiertem Thymidin)
und anschließender autoradiographischer Entwicklung, später dann durch
nichtradioaktive Verfahren, insbesondere der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
(FISH). Bei diesen Verfahren werden die Proben chemisch modifiziert,
z.B. durch Ankoppeln eines Biotin- oder eines Digoxigeninmoleküls über
einen ” Linker“ geeigneter Länge. Der Nachweis der Markierungsorte in situ
erfolgt dann durch spezifische Anbindung von Farbstoffen, z.B. von fluoreszierenden
Antikörpern. In den letzten Jahren ist auch eine direkte Markierung
der Proben mit Fluorochromen möglich geworden. Heute steht eine