Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

198 S.W. Hell
oder Probenzerstörung durch nichtlineare begrenzende Effekte. Sollten zukünftige
Forschungen ergeben, dass die nichtlinearen limitierenden Mechanismen
kubischer oder höherer Ordnung sind, so wäre die Verwendung von
Pikosekundenpulsen gegenüber den jetzt standardmäßig verwendeten Femtosekundenpulsen
generell vorzuziehen. Pulse im 2–10 ps Bereich haben auch
den Vorteil, dass sie in der Regel Laser-technisch leichter herzustellen sind
und aufgrund ihrer engen spektralen Bandbreite (< 0,1nm) mühelos über
Glasfasern vom Laser zum Mikroskop transportiert werden können, weil die
Dispersion vernachlässigbar ist.
Zusammenfassend kann man festhalten, dass man durch Femtosekundenpulse
im Prinzip das Signal der Zweiphotonenmikroskopie erhöht, dass es
aber eine Vielzahl von Experimenten gibt, die zeigen, dass man effiziente
Zweiphotonenmikroskopie auch mit Pikosekundenpulsen und in Einzelfällen
sogar mit kontinuierlich eingestrahltem Licht durchführen kann. Wird das
Laserlicht sehr stark gestreut, so sind wiederum kurze Pulse im Vorteil, weil
man mit weniger Lichtleistung auskommt. Die Durchführbarkeit hängt also
in hohem Maß vom Farbstoff und den optischen Eigenschaften der Probe ab.
9.2.5 Die Detektionseffizienz eines Rastermikroskops
Ein wichtiger Aspekt bei der Bestimmung der detektierten Fluoreszenzrate ist
die Detektionseffizienz des Mikroskopaufbaus selbst. Leider wird der größte
Teil der emittierten Photonen erst gar nicht gemessen. Dabei spielt die Sensitivität
des Detektors eine entscheidende Rolle. Die typische Quateneffizienz
von Photomultipliern liegt bei 15–20% (bei λ = 450 nm) bis herunter zu 2–
4% (bei λ = 700 nm). Aufgrund des begrenzten Aperturwinkels werden selbst
bei hohen Aperturen (1,2–1,4 Öl) lediglich 20–30% der emittierten Photonen
aufgesammelt. Bedenkt man, dass die Mikroskope einschließlich der Filter nur
eine Transmission von 50–70% haben, so erhält man als Richtwert für die Detektionseffizienz
δ =0,10× 0,20 × 0,6 ≈ 0,01. D.h., nur 1% der emittierten
Photonen werden tatsächlich als Signal registriert. Siliziumdetektoren haben
Quantenausbeuten von 50–70% im grün-gelb-roten Spektralbereich, aber sie
sind rauschempfindicher. Letzteres kann man unterbinden, indem man sie als
Photonenzähler betreibt, aber dadurch ist die maximale Zählrate auf 2×10 6 /s
begrenzt. Sie sind daher (nur) bei schwachen Signalen von Vorteil.
9.2.6 Anwendungsbeispiele der Multiphotonenmikroskopie
Trotz der noch nicht vollständig geklärten Limitationen gibt es bereits beeindruckende
Anwendungsbeispiele in der biomedizinischen Forschung. Dies ist
nicht zuletzt darauf zurückzuführen, dass fast alle gängigen Fluorophore
multiphotonenanregbar sind. Aber auch viele intrinsischen Farbstoffe der
Zelle lassen sich durch die simultane Absorption von zwei oder drei Photonen
zur Fluoreszenz anregen. Beispiele dafür sind Pollenkörner, die eine