Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

210 S.W. Hell
Es gibt noch eine weitere Methode, die Nebenmaxima im 4π-konfokalen
Mikroskop zu entfernen und die Auflösung nicht nur axial, sondern auch lateral
zu steigern. Wie in jedem anderen Fluoreszenzmikroskop auch, lässt sich
aus dem Bild b(u, v) und bekannter effektiver PSF h(u, v) auf das Objekt
t(u, v) rückschließen, und zwar indem man das Bild mit der (gemessenen) effektiven
PSF h(u, v) entfaltet. Im Prinzip könnte man die Entfaltung direkt
durchführen und somit eine gewisse Restaurierung des Objekts erreichen.
In Wirklichkeit ist in der Fluoreszenzmikroskopie eine direkte Entfaltung
kaum praktikabel, in erster Linie wegen des zumeist unzulänglichen SNR
des Bilds und der gemessenen PSF. Trotzdem ist es möglich eine Art Entfaltung
– besser Objektrestauration – in einem iterativen Approximationsprozess
durchzuführen. Ein entsprechender Algorithmus nimmt eine gewisse
Objektfunktion an, die aufgrund der räumlichen Ausdehnung der PSF in
ein Bild umgewandelt wird. Das errechnete Bild wird mit dem gemessenen
Bild verglichen und das Objekt neu abgeschätzt. Der Prozess wird sukzessive
wiederholt, bis die im Algorithmus angenommene Objektfunktion t(u, v)
nach einer Faltung mit h(u, v) das gemessene Bild b(u, v) wiedergibt. Als
Randbedingung kann man festhalten, dass die Objektfunktion positiv sein
muss, t(u, v) ≥ 0. Restaurationsverfahren dieser Art werden erst dann zuverlässig
und effizient, wenn sowohl h(u, v) alsauchb(u, v) mitadäquat hohem
SNR gemessen ist. Darüber hinaus muss sichergestellt sein, dass die
PSF während der Bildaufnahme translationsinvariant ist. Es gibt mittlerweile
eine Reihe von Algorithmen, die sich aufgrund moderner und leistungsfähiger
Rechner effizient einsetzen lassen. Einer davon ist der Maximum-Likelihood-
Estimation-Algorithmus.
Restauriert man 4π-konfokale Bilder mit der PSF des 4π-konfokalen Mikroskops,
h 4π,A
2phot−conf , so lassen sich tatsächlich dreidimensionale Fluoreszenzbilder
von bisher unerreichter Schärfe erstellen. Abbildung 9.13 zeigt einen
Vergleich einer zweiphotonenkonfokalen Aufnahme a mit der einer 4π-konfo-
kalen mit anschließender Restauration mittels h 4π,A
2phot−conf
in b. Bei dem Ob-
jekt handelt es sich ebenfalls um willkürlich verteilte Fluoreszenzlatexpartikel
von 100 nm Durchmesser. Die Bilder wurden im gleichen Objektbereich
aufgenommen; der unmittelbare Vergleich zeigt eine fundamentale Erhöhung
der Auflösung in der 3D-Lichtmikroskopie. Die effektive Auflösung liegt im
Bereich von ca. 80–100 nm in axialer Richtung und ca. 120 nm in lateraler
Richtung, bei einer Anregungswellenlänge von 810 nm und einer mittleren
Fluoreszenzwellenlänge von 580–600 nm.
Abbildung 9.14 zeigt ein Anwendungsbeispiel in einer Mausfibroblastzelle.
Dabei wurden Details aus mit einem Fluoreszenzmarker versehenen Aktinfilamenten
abgebildet: a zeigt das zweiphotonenkonfokale Bild, während b
dessen 4π-konfokales Pendant nach einer Entfaltung durch die 4π-konfokale
PSF. Wiederum ergibt der Vergleich eine deutliche Auflösungserhöhung zugunsten
des Letzteren.