Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

180 S.W. Hell
Was bedeutet nun Auflösung und was hat es mit der Abbe-Auflösungsgrenze
auf sich? Die Auflösung ist zweifelsohne die wichtigste Eigenschaft
eines Mikroskops, weil sie die feinste Struktur bestimmt, die man in einem
Mikroskop als solche erkennen kann. Dabei liegt die Betonung auf Struktur,
d.h. im einfachsten Fall sind es zwei feine, gleichartige, punkt- oder linienförmige,
eng benachbarte Objekte. Die Struktur gilt als aufgelöst, wenn
man sie im Bild getrennt wahrnehmen kann. Als Beispiel könnte man zwei
Genabschnitte nehmen, die 200 nm voneinander entfernt sind. In der Tat ist
ca. 200 nm in etwa der kleinste Abstand, bei dem man zwei gleichartige Objekte,
z.B. zwei fluoreszierende Moleküle oder Molekülanhäufungen in einem
Standardfluoreszenzlichtmikroskop als getrennte Objekte wahrnehmen kann.
Woran liegt das? Der eigentliche Prozess, der bei der Abbildung stattfindet,
lässt sich zumindest für die Fluoreszenzmikroskopie einfach formulieren.
Nehmen wir an, wir hätten ein selbstleuchtendes Objekt. Laut geometrischer
Optik wäre die Rolle der Linse oder des abbildenden Linsensystems
zwei beliebig gewählte, benachbarte, leuchtende Objektpunkte in zwei benachbarte
Bildpunkte zu verwandeln. Die Bildpunkte sollen einen größeren
Abstand besitzen, um ihn dem Auge zugänglich zu machen. Die fundamentale
Erkenntnis Abbes war nun, dass die beiden Bildpunkte nicht – wie von der
geometrischen Optik vorhergesagt – von jeweils einem einzigen Objektpunkt
stammen können, sondern von einem Objektbereich, dessen Ausdehnung
durch das Beugungsmuster des Lichts an der Öffnung des Objektivs bestimmt
ist. Ein gutes Maß für diesen Bereich ist der Radius des Hauptmaximums des
Beugungsmusters, ∆r, der sich aus
∆r = 0,61λ
(9.1)
n sin α
ergibt. Der Parameter n ist dabei der Brechungsindex der Probe, λ ist die
Wellenlänge des Fluoreszenzlichts und α ist der halbe Öffnungswinkel des Objektivs.
Das Produkt n sin α = NA wird als numerische Apertur bezeichnet.
Setzt man übliche Werte wie λ = 550 nm und NA =1,3 ein,soerhält man
∆r ≈ 260 nm. D.h., Objektpunkte die näher als ∆r sind, lassen sich bei dieser
Wellenlänge nicht klar voneinander trennen. Damit ist das Auflösungsproblem
als Beugungsproblem definiert, das sich durch eine Verkleinerung der
Wellenlänge verbessern, aber nicht lösen ließe. Die Verkleinerung von ∆r
durch kürzere Wellenlängen und etwas größere Aperturen ist zwar denkbar,
aber es gibt technische Hürden, die numerische Aperturen über 1,4 und
Wellenlängen unter 350 nm verhindern. Man muss deshalb von einer Grenze
von ∆r ≈ 180 nm im Standardfluoreszenzmikroskop ausgehen. (Das Modell
des Selbstleuchters ist auf die Fluoreszenz übertragbar, weil die Phase des
anregenden Lichts verlorengeht und die Farbstoffmoleküle in guter Näherung
als Selbstleuchter betrachtet werden können.)
Es soll hier am Rande bemerkt werden, dass Auflösung mit der Kleinheit
der Objekte, die im Mikroskop sichtbar sind, wenig zu tun hat. So ist es
ohne weiteres möglich, einzelne Fluoreszenzmoleküle von der Größe von ein