Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

9 Hochauflösende 3D-Lichtmikroskopie 205
zusammengeführt, so ist die Detektionswellenfront vergrößert und man erhält
eine genauere Information über die Lage des emittierenden Objekts. Die
kohärente Verwendung zweier Objektive hoher numerischer Apertur für Beleuchtung
und/oder Detektion eines Objektpunkts ist die Grundidee, auf der
das 4π-konfokale Mikroskop aufbaut. Mit zwei Objektiven hoher Apertur erreicht
man zwar keinen Raumwinkel von 4π — das Akronym soll aber an die
Grundidee erinnern. Im Folgenden wird aber noch gezeigt werden, dass das
Erreichen eines 4π-Raumwinkels gar nicht erforderlich ist.
Die 4π-Intensitäts-PSF berechnet sich demzufolge durch die Addition der
Amplituden-PSF der entgegengerichteten Objektive:
h 4π �
�
(u, v) = �� h1(u, v) ± � �
�
h2(−u, v) � 2
. (9.13)
Das Vorzeichen von u trägt der entgegengesetzten axialen Ausrichtung des
zweiten Objektivs Rechnung. Das ” +“ Zeichen gilt für konstruktive Interferenz,
während das ” −“für destruktive Interferenz im geometrischen Fokuspunkt
steht. Wie in Abb. 9.9 zu sehen, ist die 4π-Intensitäts-PSF deutlich
durch die Interferenz geprägt. Außer dem ca. 4-mal engeren Hauptmaximum
erhält man auch ausgeprägte Nebenmaxima (Abb. 9.9 rechts).
Der Verlauf der 4π-PSF ist stark von der Apertur abhängig. Die Zahl der
Nebenmaxima nimmt mit zunehmendem Aperturwinkel, α, der Objektive ab,
weil man sich mit zunehmendem α der ” Idealsituation“ eines Raumwinkels
von 4π nähert. Bei einem Aperturwinkel von α ≥ 1,13 (≈ 65 ◦ )erhält man fast
nur noch zwei ausgeprägte Nebenmaxima, deren Höhe ca. 65% des Hauptmaximums
beträgt. Würde man den Winkel noch weiter steigern, so nähmen
die Nebenmaxima schnell ab; technisch ist das leider kaum realisierbar, denn
α ≈ 1,13 ist der Raumwinkel der größten Ölimmersionsobjektive. Nimmt
man Objektive niedrigerer Apertur, so nimmt dagegen die Zahl und Höhe der
Nebenmaxima zu, was unerwünscht ist. Deshalb sind Ölimmersionsobjektive
der numerischen Apertur von 1,4 ≈ 1,5 × sin(α) die bevorzugten Objektive.
Die Verwendung von Objektiven niedriger Apertur wäre auch ein Widerspruch
zur Grundidee des ” 4π“-Mikroskops.
Abbildung 9.10 skizziert die optische Anordnung eines 4π-konfokalen Mikroskops.
Das Objektiv L2 ist fest; das Objektiv L1 wird hochpräzise (10 nm),
piezoelektrisch zu L2 positioniert. Die Bildgewinnung erfolgt durch Rastern
des Objekts durch den Fokus. Das registrierte Fluoreszenzsignal wird an
einen Rechner weitergeleitet, mit dessen Hilfe das Bild dargestellt wird. Bei
Abb. 9.10 handelt sich um einen konfokalen Aufbau, d.h. die Fluoreszenz wird
auf eine Punktlochblende abgebildet. Damit ist das 4π-konfokale Mikroskop
auch bei Einphotonenanregung in der Lage, dreidimensionale Bilder zu erstellen.
Die konfokale Anordnung erlaubt drei Typen von 4π-konfokaler Mikroskopie.
Entweder man beleuchtet kohärent durch beide Objektive (Typ A),
oder man detektiert kohärent (Typ B) oder man tut beides zugleich (Typ C).
Bei Typ A hat nur die Beleuchtungs-PSF die Gestalt einer 4π-Intensitäts-