Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

10 Flusszytometrie 223
10.3.3 Detektionsoptik
Für die Detektion von Fluoreszenz- und Seitwärtsstreulicht sollte die Sammeloptik
eine möglichst hohe numerische Apertur besitzen, um einen möglichst
hohen Anteil des Lichts zu registrieren. In einigen Flusszytometern hat man
dazu auf der zur Sammellinse gegenüber liegenden Seite des Flusssystems
einen sphärischen Spiegel montiert, dessen Fokalpunkt im Schnittpunkt von
Anregungslaserstrahl und Probenstrom liegt. Im Fall von Vorwärtsstreulicht
besteht dieses Empfindlichkeitsproblem nicht. Hier ist nur darauf zu achten,
dass der primäre Laserstrahl ausgeblendet wird. Die Detektion erfolgt mit
einer Photodiode.
Streulichtmessungen werden als Diskriminationsparameter nach Größe
und Gestalt herangezogen. Für Partikel kleiner als die Wellenlänge wird die
Steuung durch die Rayleigh-Theorie, für größere Partikel durch die Mie-
Theorie beschrieben, die eine exakte Lösung der Maxwell-Gleichungen für
homogene, kugelförmige Partikel darstellt.
Im Fall inhomogener, nicht kugelförmiger Partikel, wie sie Zellen oder
andere biolgische Proben bieten, ist man auf Näherungen angewiesen wie z.B.
die Rayleigh-Gans-Approximation oder andere komplexe numerische Näherungen,
die heute mit leistungsfähigen Computern berechnet werden können.
Da all diese Ansätze den Rahmen dieses Kapitels übersteigen, sei an dieser
Stelle auf Kap. 5 des Lehrbuches von Melamed et al. verwiesen, sodass ich
mich auf eine kurze, mehr intuitive Beschreibung beschränken kann.
Man stelle sich die Oberfläche eines Partikels aus einer Reihe kleiner
Dipole zusammengesetzt vor, die von der anregenden Lichtquelle in Schwingungen
versetzt werden. Das Streulicht setzt sich dann aus den Einzelwellen
von diesen Dipolen zusammen. Da die Dipole alle in Phase angeregt werden
und einen festen räumlichen Abstand zueinander haben, hängt die Intensität
des gestreuten Lichts von der Interferenz der Einzelwellen und deren relativen
Phasenbeziehung ab.
Zur Vereinfachung und ohne Beschränkung der Allgemeinheit seien die
Dipole in einer Reihe senkrecht zum anregenden Lichtstrahl mit festen Abständen
zueinander angeordnet. In Vorwärtsrichtung sind somit alle Dipole
in Phase. Die Intensität des Verwärtsstreulichts ist damit proportional zum
Quadrat der Gesamtzahl der Dipole. Für die Praxis ist das Vorwärtsstreulicht
damit stark von der Größe der Partikel abhängig.
Nimmt man nun weiter an, dass das Maximum der Abstände der Dipole in
der Größe von etwa der halben Wellenlänge des anregenden Lichts sein kann,
so können beim Seitwärtsstreulicht einige Wellenzüge destruktiv interferieren.
Wird das gemessene Partikel nun größer, ohne die Regelmäßigkeit seiner Form
(hier lineare Anordnung der Dipole) zu ändern, so erhöht sich die Zahl der
destruktiven Interferenzen. Die Intensität des Seitwärtsstreulichts verändert
sich nur unwesentlich. Verändert man aber die Anordnung der Dipole, d.h.
die Form der zu messenden Partikel, so können die destruktiven Interferenzen
verschwinden, und die Streulichtintensität ändert sich.