Medizinische Physik 3: Medizinische Laserphysik [2004]

9 Hochauflösende 3D-Lichtmikroskopie 183
Abb. 9.1. Anordnung eines konfokalen Fluoreszenzrastermikroskops bestehend aus
Laser, Lochblenden, Farbteiler (DC) und Objektiv. Bei Multphotonenanregung
wird in der Regel die Lochblende vor dem Detektor entfernt
dem geometrischen Bildpunkt der Punktlichtquelle konvergieren würde. Aufgrund
der Beugung erhält man aber eine dreidimensionale Intensitätsverteilung
mit dem geometrischen Fokus als Zentrum, die sich aus den Parametern
Wellenlänge und Apertur, d.h. Öffnungswinkel der konvergierenden Wellenfront
berechnet. In guter Näherung ergibt sich die fokale Intensitätsverteilung
aus
�
�
I(u, v) =C��
�
�
h(u, v) � 2
= Ch(u, v) =C ′
��
� 1
�
� J0(vρ)exp(
0
1
2 iuρ2 �2
�
)ρdρ�
� . (9.2)
Die Variablen u und v sind optische Koordinaten, die mit den Ortskoordinaten,
x, y, z über die Beziehung
u =8πnz sin 2 (α/2)/λ bzw. v =2πnr sin(α)/λ
definiert sind. J0 ist die Bessel-Funktion nullter Ordnung. Ferner gilt r =
� x 2 + y 2 . C ist eine Normierungskonstante, um die Funktion h(u, v) dimensionslos
und auf Eins zu normieren. Die Funktion � h(u, v) ist proportional zur
elektrischen Feldstärke im Fokus. Da wir hier von Beleuchtung gesprochen
haben, können wir h(u, v) als Beleuchtungspunktabbildungsfunktion (engl.
illumination point-spread-function, I-PSF) des Objektivs bezeichnen und mit
einem Index hill(u, v) versehen. Die optischen Koordinaten u und v werden
häufig statt der realen Ortskoordinaten verwendet, weil sie die (offensichtliche)
Abhängigkeit der PSF von der Wellenlänge und der Apertur herausnormieren
und so eine universellere Beschreibung der PSF erlauben.
Die numerische Berechnung der Beleuchtungs-PSF ergibt eine zylindersymmetrische
Intensitätsverteilung um den geometrischen Fokus. Diese ist
in Abb. 9.2a für den Spezialfall der numerischen Apertur von 1,35 (Öl) und
λ = 488 nm berechnet und in Ortskoordinaten dargestellt. Das Intensitätsmaximum
befindet sich im geometrischen Fokuspunkt und nimmt nach außen
hin ab. In der Fokalebene (z,u = 0) ist die fokale Intensitätsverteilung durch
h(0,v) gegeben (Abb. 9.3a). Man erkennt ein Hauptmaximum und ein erstes