Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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vi A.3 Abbildungsverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232 A.4 Tabellenverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235 A.5 Danksagung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237 Lebenslauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239 Publikationsliste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242
1 Zusammenfassung Die RNA-Interferenz (RNAi) ist ein hoch spezischer posttranskriptioneller Mechanismus zur Genregulation, der in allen höheren Organismen bis hin zum Menschen vorkommt. Dabei kommt es durch den Ribonukleoproteinkomplex RNA-induced silencing complex (RISC) zur sequenzabhängigen Erkennung und Bindung einer target mRNA, deren Translation daraufhin durch eine endonukleolytische Spaltung oder durch sterische Blockade verhindert wird. Die Schlüsselkomponente des humanen RISC stellt das Argonaute2 Protein (hAgo2) dar, welches mit der Nukleinsäurekomponente, einer guide RNA, assoziiert ist. Es setzt sich aus der N- terminalen, Mid, PAZ und PIWI Domäne zusammen. Die Fähigkeit, beliebige guide RNAs zu binden, macht hAgo2 zum molekularen Universalwerkzeug der Zelle. Diese Dissertation beschäftigt sich mit der biochemischen und kinetischen Charakterisierung von rekombinantem hAgo2 durch in vitro Studien. Zunächst wurden für die Gewinnung ausreichender Mengen an enzymatisch aktivem, rekombinantem hAgo2 teilweise parallel fünf verschiedene Expressions- und Reinigungssysteme entworfen und getestet. Die zentralen Probleme stellten die schlechte Löslichkeit sowie die teilweise unvollständige Translation der Fusionsproteine dar. Dennoch gelang u. a. die Gewinnung von hAgo2 mit einer N-terminalen GST-Markierung unter nicht-denaturierenden Bedingungen im Milligramm-Maÿstab mit hoher enzymatischer Aktivität. Alle hAgo2-Konstrukte wiesen die typische sequenzspezische target RNA-Spaltung auf, wobei ein C-terminal modiziertes Konstrukt einen drastisch verminderten Umsatz zeigte. Dies lässt sich auf eine gestörte Proteinfaltung zurückführen und unterstreicht die ähnliche Domänenstruktur prokaryonter und eukaryonter Ago Proteine. Weiterhin konnten Erkenntnisse über das Mg 2+ -Optimum sowie das Oligomerisierungsverhalten von hAgo2 gewonnen werden. Es wurde eine Aggregationstendenz festgestellt, die temperaturinduzierbar ist. Diese kann durch Zugabe von RNA fast vollständig inhibiert werden. Die Dissertation beschäftigte sich zentral mit der biochemischen und kinetischen Charakterisierung der siRNA-vermittelten target RNA Spaltung durch hAgo2. Es gelang die Untergliederung des Gesamtprozesses in vier Teilschritte (Beladung von hAgo2 mit siRNA, Erkennung und Bindung der target RNA, ihre Spaltung und die Freisetzung der Spaltprodukte) sowie deren individuelle experimentelle Untersuchung. Zunächst wurde die Beladung von hAgo2 analysiert. Zu diesem Zweck konnte ein uoreszenzbasiertes System entwickelt werden, mit dessen Hilfe die Bindungsreaktion von hAgo2 mit einzelsträngiger und doppelsträngiger siRNA unter steady state und pre-steady state Bedingungen untersucht wurde. Es konnte erstmalig gezeigt 1
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Seite 15 und 16: 2 Einleitung 2.1 Über die Bedeutun
Seite 17 und 18: 2.2 Genregulation durch RNA-Interfe
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Seite 31 und 32: 2.4 Die strukturellen und molekular
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Seite 35 und 36: 2.5 Die Kinetik der siRNA-vermittel
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Seite 39 und 40: 2.6 Die Familie der dsRNA-bindenden
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Seite 48 und 49: 3 Material UV-Quarzküvetten (70 µ
Seite 50 und 51: 3 Material Stains-All Sigma-Aldrich
Seite 52 und 53: 3 Material Coomassie-Entfärbelösu
Seite 54 und 55: 3 Material Trenngelpuer (4×) 1,5 M
Seite 56 und 57: 3 Material pQE-T7-His-hAgo2 Eigensc
Seite 58 und 59: 3 Material 3.8.4 Primer Name Ago2 f
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3 Material Anti-Tetra-His (monoklon
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4 Methoden Mini-Präparation (klein
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4 Methoden Acrylamidkonzentration (
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4 Methoden Die in vitro Transkripti
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4 Methoden schwache Absorption aufw
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4 Methoden Komponente Sammelgel Tre
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4 Methoden Es wurde für 90 min ein
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4 Methoden Protein Temperatur der H
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4 Methoden Die Rückfaltung von hAg
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4 Methoden Reinigung von hTRBP-His
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4 Methoden Ansätzen zum Reaktionss
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4 Methoden Abbildung 4.1: Schematis
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4 Methoden Xenon‐Lampe Excitation
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4 Methoden gewertet; allerdings die
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4 Methoden verwendeten Lösungsmitt
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5 Ergebnisse NHA-hAgo2 nur in Anwes
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5 Ergebnisse Konstrukte wurden mit
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5 Ergebnisse NHA hAgo2 A DNaseI & T
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5 Ergebnisse konnte mit der bisher
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5 Ergebnisse Präzipitationskontrol
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5 Ergebnisse Studien zur Optimierun
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5 Ergebnisse zum Anderen den angest
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5 Ergebnisse 5.4.3 Entwicklung eine
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5 Ergebnisse In beiden Experimenten
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Mass (%) 5 Ergebnisse NHA hAgo2 90
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Fluoreszenz cpm 5 Ergebnisse GST hA
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Fluoreszenz 5 Ergebnisse Bestimmung
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elative Fluoreszenz k 1, obs (s -1
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Fluoreszenz 5 Ergebnisse GST hAgo2
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Fluoreszenz 5 Ergebnisse GST hAgo2
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5 Ergebnisse und ist somit konsiste
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% Umsatz % Umsatz 1/ k k (s -1 ) 5
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Fluoreszenz 5 Ergebnisse Wie unter
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Fluoreszenz Fluoreszenz 5 Ergebniss
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elative Fluoreszenz k 1, obs (s -1
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% Umsatz 5 Ergebnisse wird, stehen
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6.5 Modell der minimalen rekombinan
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6.6 Ausblick einer konformationelle
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7 Literaturverzeichnis [1] Paterson
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A Anhang Bindungspartner miteinande
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A Anhang Å Ångström µF Mikrofar
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A Anhang meinen Freunden für Vers
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Publikationsliste Originalartikel 2
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