Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

elative Fluoreszenz
k 1, obs (s -1 )
relative Fluoreszenz
k 1, obs (s -1 )
5.7 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hAgo2
Untersuchung der Assoziation und Dissoziation von ssRNA und hAgo2
Zunächst wurde die Komplexbildung von NHA-hAgo2 mit den guide Strängen P-as2B-FAM
und OH-as2B-FAM untersucht. Je 20 nM Substrat wurden mit einer konstanten Konzentration
NHA-hAgo2 im Bereich von 300 800 nM rasch gemischt und die Fluoreszenzänderung
aufgezeichnet. Für jede Proteinkonzentration wurden die Daten mathematisch mit Hilfe einer
exponentiellen Gleichung ausgewertet (siehe Abbildung 5.26 A und C).
Die Kinetik kann am besten mit einer dreifach exponentiellen Gleichung beschrieben werden.
Das bedeutet, dass während der Assoziation eines binären Komplexes mindestens drei Phasen
NHA
hAgo2
A
1,1
B
80
1
0,9
0,8
1,08
1,04
1
0,96
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
60
40
0,7
20
0,6
C
1,1
0 200 400 600 800
Zeit (s)
D
0
0 200 400 600 800
NHA-hAgo2 (nM)
80
1
1,08
1,04
60
0,9
1
0,96
40
0,8
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
0,7
20
0,6
0 200 400 600 800 1000
Zeit (s)
0
0 200 400 600 800
NHA-hAgo2 (nM)
Abbildung 5.26: Pre-steady state Assoziationskinetik von NHA-hAgo2 und 5'-phosphorylierter
versus unphosphorylierter guide RNA (siehe Abschnitt 4.4.3). (A) Repräsentative stopped ow
Messung der Komplexbildung aus 20 nM P-as2B-FAM und 500 nM NHA-hAgo2. Die Daten wurden
mit einer dreifach exponentiellen Gleichung ausgewertet und ergaben k 1, obs = 35,8 (± 8,3) s -1 ,
k 2 = 0,11 (± 0,0018) s -1 und k 3 = 0,0097 (± 0,00005) s -1 . (B) Abhängigkeit von k 1, obs u. a. aus (A) von
der NHA-hAgo2-Konzentration. Es ergab sich k 1 = 0,6 (± 0,001) × 10 8 M -1 s -1 und k -1 = 6,2 (± 0,62) s -1 .
(C) Repräsentative stopped ow Messung der Komplexbildung aus 20 nM OH-as2B-FAM und 400 nM
NHA-hAgo2. Die Daten wurden mit einer dreifach exponentiellen Gleichung ausgewertet und ergaben
k 1, obs = 28,6 (± 16,1) s -1 , k 2 = 0,11 (± 0,0021) s -1 und k 3 = 0,0087 (± 0,00004) s -1 . (D) Abhängigkeit von
k 1, obs u. a. aus (C) von der NHA-hAgo2-Konzentration. Es ergab sich k 1 = 0,6 (± 0,05) × 10 8 M -1 s -1
und k -1 = 5,5 (± 3,3) s -1 .
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