Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
Studien zur Optimierung der Reinigung von GST-hAgo2 und GST-hAgo2-His
im analytischen Maÿstab
Unter Abschnitt 4.3.8 ist das Protokoll mit den optimierten Bedingungen für eine Reinigung
von GST-hAgo2-His und GST-hAgo2 im analytischen Maÿstab aufgeführt. Die Experimente
zur Ermittlung dieser optimierten Bedingungen sind im Folgenden beschrieben.
Es wurden pro Experiment etwa 800 mg Bakterienzellen verwendet. Für die Bestimmung
der optimalen Bedingungen wurden die Zusammensetzung des Aufschlusspuers, die Länge
der Ultraschallbehandlung, die Inkubation der löslichen Proteinfraktion mit der Säulenmatrix
bezüglich Dauer, Art und Temperatur, die Zusammensetzung des Elutionspuers sowie
Art, Dauer und Temperatur während der Elution variiert. Die Integrität der Säulenmatrix
wurde getestet, indem ein GST-Luciferase-Fusionsprotein nach optimiertem Protokoll (siehe
Abschnitt 4.3.8) erfolgreich gereinigt wurde.
Der Zellaufschluss erfolgte unter nicht-denaturierenden Bedingungen in Anwesenheit von
0,5 10 mM DTT sowie unterschiedlich stringentem Ultraschall. Zwar sollte der gröÿtmögliche
Anteil an Zellen lysiert werden, jedoch ohne eine Beeinträchtigung der Proteinfaltung.
Nach Abtrennung unlöslicher Zellbestandteile durch Zentrifugation wurde der die löslichen
Proteine enthaltende Überstand mit der Säulenmatrix Glutathion Sepharose 4B für 1 16 h
bei Raumtemperatur oder 4 ◦ C unter ständiger Bewegung inkubiert. Alternativ wurde die
Säulenbeladung bei Raumtemperatur durch die gravity ow Methode getestet. Zuvor war die
Säulenmatrix mit einem Bindungspuer equilibriert worden, der die dem Aufschlusspuer
entsprechende Konzentration DTT enthielt. Zusätzlich wurde der Einuss von 150 300 mM
NaCl, 10 % Glyzerin und 0,5 5 mM reduziertes Glutathion im Bindungspuer untersucht. Zur
Optimierung der Elution wurde die Konzentration von reduziertem Glutathion von 10 20 mM
variiert und der Einuss von 2 M NaCl untersucht. Die Elution wurde mit unterschiedlichen
Volumina bei Raumtemperatur oder 4 ◦ C für 10 min 16 h unter ständiger Bewegung oder
nach der gravity ow Methode durchgeführt.
Die beiden Konstrukte zeigten in den Experimenten dasselbe Verhalten, so dass für GSThAgo2-His
und GST-hAgo2 ein identisches Protokoll entwickelt wurde. Die besten Ergebnisse
wurden erzielt, wenn die Bakterienzellen in Anwesenheit von 10 mM DTT durch eine milde
Ultraschallbehandlung (2 × 1 min mit 30 % Power und 60 % Cycle, gefolgt von 1 min Inkubation
auf Eis) lysiert wurden. Die Säulenmatrix wurde ebenfalls in Anwesenheit von 10 mM DTT
äquilibriert; auf die Verwendung von Glyzerin und NaCl wurde verzichtet, da dies die Bindung
des Proteins beeinträchtigte. Die Beladung der Matrix erwies sich bei 4 ◦ C für 16 h unter
ständiger Bewegung als optimal. Die mit Proteinen beladene Matrix wurde mit Bindungspuer
gewaschen. Für eine optimierte Elution wurde sie anschlieÿend mit 1 Säulenvolumen
Elutionspuer mit 20 mM reduziertem Glutathion bei Raumtempertaur für 10 min inkubiert
und nach der gravity ow Methode eluiert. Mit dem optimierten Protokoll konnte aus 1 g
Bakterienzellen ca. 0,6 mg Protein gereinigt werden.
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