Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.3 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung durch hAgo2
rückgrat zwischen seinem ersten und zweiten Nukleotid auf [119]. Da die Ratenkonstanten des
zweiten Bindungsschrittes jeweils sehr ähnlich sind, scheint dies jedoch keinen limitierenden
Faktor für die Reaktion darzustellen. Statt dessen ist ein signikanter Unterschied bei der
Dissoziation zu beobachten. Möglicherweise wird die Rückreaktion durch den energetischen
Vorteil beschleunigt, der die Paarung des frei werdenden 5'-terminalen Nukleotides des guide
Stranges mit der passenger RNA begleitet.
In einem binären Komplex aus T. thermophilus Ago und einer 21 nt langen guide DNA liegt
nicht nur das 5'-Ende gebunden vor. Es ist auch eine Verankerung des 3'-Endes in der PAZ Domäne
erforderlich [28, 120]. Eventuell beschreibt die dritte beobachtete Phase konformationelle
Änderungen im Komplex, die mit diesem Prozess einhergehen. Die Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten
des dritten Bindungsschrittes für die drei Substrate P-as2B-FAM,
OH-as2B-FAM und P-si2B-FAM sind sich sehr ähnlich (siehe Tabelle 5.2). Die beiden einzelsträngigen
siRNAs unterscheiden sich nicht in ihrem 3'-terminalen Bereich. Wenn man die
letzten beiden Nukleotide des guide Stranges von P-si2B-FAM betrachtet, so sind auch diese
nicht nur sequenzidentisch, sondern auf Grund der Überhänge ungepaart. Die PAZ Domäne
weist eine unspezische Anität für einzelsträngige siRNAs auf [121123, 125] und bindet
nicht mehr als 2 nt (siehe Abbildung 2.4 B). Deshalb sind unterschiedliche Ratenkonstanten
bei der Verankerung des 3'-Endes in der PAZ Domäne auch nicht zu erwarten.
Die Unterschiede zwischen Assoziation und Dissoziation spiegeln sich auch in Daten von
Lima et al. wider, die die Kinetik der Bindungsreaktion von GST-hAgo2 und einer 19 nt langen,
phosphorylierten guide RNA unter Gleichgewichtsbedingungen untersuchten [199]. Sie
bestimmten für die Assoziation eine Ratenkonstante zweiter Ordnung von 1,2 ×10 5 M -1 s -1 und
für die Dissoziation eine Ratenkonstante von 0,0068 s -1 . Da die Untersuchungen nicht im presteady
state durchgeführt wurden, konnten Assoziation und Dissoziation nicht in Teilprozesse
aufgelöst werden, wie dies in dieser Arbeit geschehen ist. Auÿerdem konnte auch in dieser
Studie eine 15-fache Beschleunigung der Dissoziation beobachtet werden, wenn bei einer sequenzidentischen
guide RNA die 5'-terminale Phosphatgruppe entfernt wurde [199].
Durch die Maskierung bestimmter Bereiche von einzelsträngigen phosphorylierten und nichtphosphorylierten
guide RNAs konnte die Interpretation der experimentellen Daten erhärtet
werden. Bei der Maskierung des 5'-Endes durch ein sperriges Fluorophor war die Bildung von
Kollisionskomplexen beobachtbar. Dieser Prozess lief mit vergleichbarer Geschwindigkeit ab.
Allerdings wurde die guide RNA nicht korrekt gebunden die Phasen zwei und drei waren
nicht zu beobachten. Dies ist konsistent mit Studien, bei denen die Maskierung des guide
Strang-5'-Endes eine starke Beeinträchtigung der RNAi zeigte [170172] und impliziert, dass
die Verankerung des 5'-Endes in der Mid Domäne nicht stattnden konnte. Weiterhin legt
dies die Annahme nahe, dass es sich bei den Phasen zwei und drei um sequenzielle Prozesse
handelt, da auch die dritte Phase der Bindungsreaktion nicht länger beobachtet werden konnte.
Die Maskierung von zentralen Bereichen oder des 3'-Endes der guide RNA führte nicht zu
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