Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
guide RNA target RNA k 1, obs k 2 k 3
System
(s -1 ) (s -1 ) (s -1 )
P-as2B-FAM s2B-BHQ 17,0 0,0111 0,0034 siehe Abbildung 5.31 A
P-s2B as2B-FAM 32,5 0,0110 0,0030 siehe Abbildung 5.31 B
P-as2B-FAM s2B 34,3 0,0112 0,0025 siehe Abbildung 5.31 C
Tabelle 5.3: Zusammenfassung der Ratenkonstanten der Assoziationsreaktion von binärem GSThAgo2/guide
RNA-Komplex und target RNA mit drei unabhängigen experimentellen Ansätzen.
Um zu überprüfen, ob die Assoziation des ternären Komplexes auf der Komplementarität
von guide und target RNA beruht, wurde eine Kontrollmessung durchgeführt, bei der 600 nM
GST-hAgo2 in einem Fall mit der guide RNA P-s2B, im anderen Fall mit P-asGL3 für 15 min
bei 25 ◦ C präinkubiert wurde, bevor die binären Komplexe rasch mit der nur zu P-s2B komplementären
target RNA as2B-FAM gemischt wurde. Bei Komplementarität beider Nukleinsäuren
konnte der bereits beschriebene Verlauf der Bindungskurve beobachtet werden. Im Fall der
nicht-komplementären Stränge trat die erste schnelle Phase auf, wohingegen die Phasen zwei
und drei nicht zu beobachten waren (siehe Abbildung 5.34 A und B). Die Ratenkonstante
der schnellen Phase bei nicht-komplementärer guide und target RNA beträgt 24,0 (± 8,9) s -1 .
Dieses Ergebnis stellt einen weiteren Beleg dafür dar, dass es sich bei der ersten schnellen Phase
bei der Assoziation ternärer Komplexe um die Bildung von Kollisionskomplexen handelt.
Die Phasen zwei und drei erfordern demnach die Watson-Crick-Basenpaarung von guide und
target RNA und laufen vermutlich sequentiell ab.
Als weitere Kontrolle wurde die Assoziation von guide und target RNA in Abwesenheit
von GST-hAgo2 untersucht. Dafür wurden je 20 nM P-s2B und as2B-FAM rasch miteinander
gemischt und die Änderung des Fluoreszenzsignals aufgezeichnet. Die Auswertung der
experimentellen Daten mit einer dreifach exponentiellen Gleichung ergab kein sinnvolles Ergebnis.
Die Auswertung anhand einer zweifach exponentiellen Gleichung zeigte, dass es sich
bei der hAgo2-unabhängigen Hybridisierung von P-s2B und as2B-FAM um einen zweiphasigen
Prozess handelt. Es ergaben sich k 1, obs = 17,3 (± 5,2) s -1 und k 2 = 0,0056 (± 0,00001) s -1
als Ratenkonstanten. Bei der ersten Phase handelt es sich vermutlich um die Kollision der
beiden Stränge, da k 1, obs der proteinunabhängigen Hybridisierung vergleichbar ist mit der
GST-hAgo2-vermittelten Bindung der target RNA durch den binären Komplex. Die zweite in
diesem Kontrollexperiment beobachtete Phase repräsentiert vermutlich die Bildung der Doppelhelix.
Ihre Ratenkonstante ist etwa um den Faktor 2 langsamer als diejenige der zweiten
Phase der proteinvermittelten target RNA-Bindung. Dies könnte bedeuten, dass es sich bei
dieser zweiten Phase um die Bildung von Watson-Crick-Basenpaaren im seed Bereich handelt.
Da die dritte Phase in Abwesenheit von GST-hAgo2 nicht zu beobachten ist, scheint diese
einer konformationellen Änderung des Proteins zuzuordnen zu sein.
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