Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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Das Protein hAgo2 stellt die Schlüsselkomponente der RNA-Interferenz in menschlichen Zellen
dar. Es ist in der Lage, mehrere Substrate sequentiell zu binden und die endonukleolytische
Spaltung einer sequenzspezisch gebundenen target RNA zu katalysieren. Damit ist es das
einzige der vier humanen Ago Proteine, das die siRNA-vermittelte RNAi durchführen kann.
Dabei erönet die Programmierung dieses Enzyms mit unzähligen verschiedenen siRNAs oder
miRNAs die Möglichkeit, die Expression von mRNAs in Abhängigkeit des Entwicklungsstatus
des Organismus, des Zellzyklusstatus oder als Antwort auf zelluläre Reize gezielt und eektiv
zu regulieren. Dadurch wird hAgo2 zu einem zellulären Universalwerkzeug.
Obwohl die RNAi ein Arbeitsgebiet darstellt, das sich in den letzten Jahren rasant entwickelt
hat, existieren in Bezug auf das detaillierte Verständnis der elementaren Schritte bei der Programmierung
von hAgo2, der Erkennung und Bindung einer target RNA, ihrer Spaltung und
der Regeneration des katalytisch kompetenten Komplexes nur ein lückenhaftes Verständnis.
Wichtige Fragen bleiben bislang ungeklärt. Dazu gehört eine umfassende Studie der biochemischen
und kinetischen Parameter bei der siRNA-vermittelten RNAi. Ein Grund hierfür ist
die schwierige Expression und Reinigung sowie die äuÿerst problematische Handhabung von
hAgo2 in in vitro Systemen. Als Voraussetzung für die Charakterisierung von rekombinantem
hAgo2 konnte zunächst ein System entwickelt werden, das es erlaubt, im Milligramm-Maÿstab
Protein mit hoher Aktivität zu isolieren und dabei auf stabilisierende Chemikalien bei der
Lagerung zu verzichten. Weiterhin konnten Erkenntnisse über die Stabilität von hAgo2 gewonnen
werden. Damit war es möglich, die siRNA-vermittelte Erkennung und Spaltung von
target RNA durch hAgo2 zu untersuchen. Diese Dissertation stellt die erste Arbeit dar, die
derartige Studien in umfassender und detaillierter Form beschreibt. Darüber hinaus konnte
die siRNA-Bindung durch rekombinantes hTRBP untersucht werden. Zusammen mit Experimenten,
bei denen ein Einuss von hTRBP und hPACT auf die siRNA-vermittelte target
RNA-Spaltung durch hAgo2 nachgewiesen werden konnte, stellen diese Studien eine Basis für
die Zuordnung einer Funktion dieses dsRNA-bindenden Proteins innerhalb der RNAi dar. Im
Folgenden werden die Ergebnisse, die im Rahmen dieser Arbeit gewonnen wurden, diskutiert.
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