Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.9 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung durch hAgo2
5.9.4 Untersuchungen zur Bestimmung der Ratenkonstante der
Phosphodiesterhydrolyse
Laut dem Modell von Rana unterliegt der Teilprozess Erkennung und Bindung der target
RNA Spaltung Freisetzung der Produkte kinetischer Kontrolle (siehe Abbildung 2.9 B)
[22]. Vermutlich stellt die Freisetzung der Spaltprodukte hierbei den limitierenden Faktor dar
[63]. Dies impliziert, dass durch die Gesamtreaktion nicht die Geschwindigkeitskonstante des
katalytischen Schrittes, also der Phosphodiesterhydrolyse, ermittelt werden kann. Zu diesem
Zweck muss ein experimentelles System entwickelt werden, dass die Assemblierung ternärer
Komplexe ohne die gleichzeitige Spaltung der target RNA erlaubt. Dies war bereits im Rahmen
der Charakterisierung der target RNA-Bindung durch den binären Komplex erfolgt (siehe
Abschnitt 5.8.1). Weiterhin muss die Spaltung der target RNA zu einem beliebigen Zeitpunkt
induzierbar sein. Geeignete Bedingungen wurden im Rahmen der Untersuchung zur Mg 2+ -
Abhängigkeit der Spaltungsreaktion ermittelt (siehe Abschnitt 5.5.4). Die letzte Anforderung
an das experimentelle System besteht darin, multiplen Umsatz zu unterbinden. Dies kann
durch die Verwendung einer kompetierenden RNA erfolgen, die zu Beginn der Spaltungsreaktion
in groÿem Überschuss zugesetzt wird und binäre Komplexe absättigen kann. Es wurde
ein etwa 150 nt langer Poly-A-Strang eingesetzt, der im 500-fachen Überschuss zum binären
Komplex vorlag. Dadurch konnten sowohl nicht aktive binäre Komplexe als auch freies Protein
abgesättigt werden. Abbildung 5.39 gibt einen Überblick über den experimentellen Aufbau.
In einem ersten Experiment konnte bestätigt werden, dass der gröÿte Anteil der beobachtbaren
target RNA-Spaltung auf multiple turnover zurückzuführen ist und dieser durch den
hAgo2
guide RNA
hAgo2
ternärer Komplex
hAgo2
hAgo2
0,5 mM Mg 2+ ternärer Komplex
hAgo2
hAgo2
target RNA
hAgo2
hAgo2
Kompetitor im
Überschuss
hAgo2
Abbildung 5.39: Schema des experimentellen Aufbaus zur Untersuchung des katalytischen Schrittes
der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung durch hAgo2. Zunächst erfolgt die Assemblierung
von hAgo2, guide und target RNA. Da die Konzentration der target RNA geringer als diejenige von
Protein und guide RNA ist, entstehen neben ternären auch binäre Komplexe ohne gebundene target
RNA. Zum Start der Phosphodiesterhydrolyse wird dem Ansatz 0,5 mM MgCl 2 zugesetzt. Gleichzeitig
erfolgt die Zugabe eines groÿen Überschusses kompetierender RNA, die binäre Komplexe absättigt.
Dadurch wird multipler Umsatz verhindert.
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