Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6 Diskussion
Dies unterstreicht zum Einen eine mögliche Erleichterung der target RNA-Bindung nach dem
Arrangement des seed Bereiches im binären Komplex. Zum Anderen war diese Diskrepanz
mit dem hier verwendeten GST-hAgo2 nicht zu beobachten. Dies deutet darauf hin, dass die
Wechselwirkungen der guide RNA im N-terminalen Bereich von hAgo2, also vor allem mit
der PAZ Domäne, einen hemmenden Einuss auf die Bindung der target RNA haben könnte.
Es wäre denkbar, dass eine vollständige target RNA-Bindung nur dann erfolgen kann, wenn
das 3'-Ende des guide Stranges aus der PAZ Domäne entlassen wird und in voller Länge für
RNA/RNA-Wechselwirkungen zur Verfügung steht [120, 153].
Die Assemblierung ternärer Komplexe umfasst drei Phasen
Die transientenkinetische Analyse enthüllte die Existenz von drei unterscheidbaren Phasen
während der Assoziation und Dissoziation ternärer Komplexe (siehe Abschnitt 5.8.3). Die
Assoziationsratenkonstante des ersten Bindungsschrittes ist abhängig von der Konzentration
der binären Komplexe und tritt auch bei Verwendung einer nicht-komplementären target RNA
auf, was für den zweiten und dritten Bindungsschritt nicht gilt. Sie stellt daher mit hoher
Wahrscheinlichkeit die diusionskontrollierte Bildung initialer Kollisionskomplexe dar.
Die zweite und dritte Phase sind nicht von der Proteinkonzentration abhängig. Deshalb
wird angenommen, dass sie konformationelle Umlagerungen des Komplexes beschreiben, die
während der Bildung katalytisch kompetenter ternärer Komplexe ablaufen.
Bei der Bindung einer target RNA durch einen binären T. thermophilus Ago/guide DNA-
Komplex kommt es zur partiellen Önung der basischen Bindungsfurche, um die nötige Breite
für die Assoziation mit einem Nukleinsäurehybrid zu schaen. Dies wird durch eine Verschiebung
des die N-terminale und PAZ Domäne enthaltenden Lappens erreicht (siehe Abbildung
2.8 C) [119, 153]. Nach der Bildung eines initialen Kollisionskomplexes schlieÿt sich die Paarung
des seed Bereiches an (siehe Abbildung 2.8 D) [255, 259]. Die Basenpaarung erfolgt über
maximal zehn Nukleotide und das 3'-Ende des guide Stranges bleibt in der PAZ Domäne verankert.
Dies stabilisiert den ternären Komplex [200]. Dieser Schritt der target RNA-Erkennung
entspricht mutmaÿlich der zweiten Phase bei Assoziations- und Dissoziationsreaktion. Sie ist
auch in Abwesenheit von GST-hAgo2 bei der Hybridbildung von guide und target RNA beobachtbar,
während die dritte, langsamste Phase ohne das Protein nicht auftritt.
Bevor es über den seed Bereich hinaus zu weiteren Basenpaarungen kommen kann, muss
das 3'-Ende des guide Stranges aus der PAZ Domäne entlassen werden (siehe Abbildung
2.8 D), was einer Art Schalterfunktion für den Wechsel zwischen aktivem und nicht aktivem
hAgo2 gleichkommt [120, 153]. Die strukturellen Daten bestätigen somit das ursprünglich von
Tomari und Zamore aufgestellte two state Modell [191]. Auch dieser Prozess ist mit einer
konformationellen Umlagerung verbunden, die durch die dritte Phase repräsentiert werden
könnte. Diese Annahme wird durch die Tatsache untermauert, dass die dritte Phase bei der
Dissoziation des binären Komplexes eine sehr ähnliche Ratenkonstante aufweist wie die dritte
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