Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

% Umsatz
% Umsatz
5.5 Biochemische Charakterisierung von rekombinantem hAgo2
5 mM MgCl 2 wurde die enzymatische Aktivität wiederhergestellt [200]. Rivas et al. beobachteten,
dass bakteriell exprimiertes, rekombinantes GST-hAgo2 ohne den Zusatz von Mg 2+ keine
Spaltungsaktivität aufweist [62].
Im Folgenden wurde der Einuss von Mg 2+ auf die Spaltungsaktivität des hier verwendeten
rekombinanten GST-hAgo2 untersucht. Es wurden Standard-Spaltungsansätze in 1 × Ago2-
Bindungspuer gemischt und für 10 min bei 37 ◦ C in An- oder Abwesenheit von 1 mM EDTA
präinkubiert. Die Spaltung wurde durch Zugabe von MgCl 2 in verschiedenen Konzentrationen
gestartet (siehe Abbildung 5.14 A und B).
A
0 mM 1 mM
+ + + + + + + + +
+ + + + + + + + +
+ + + + + + + + +
GST
hAgo2
5 mM MgCl 2
B 0 mM 1 mM 5 mM MgCl 2
GST-hAgo2
target RNA
guide RNA
t (min)
+ + + + + + + + +
+ + + + + + + + +
+ + + + + + + + +
GST-hAgo2
target RNA
guide RNA
t (min)
IVT (140 nt)
IVT (140 nt)
5’-Spaltprodukt
(87 nt)
0 mM EDTA 1 mM EDTA
C
40 40
5’-Spaltprodukt
(87 nt)
30
30
0 mM
0,5 mM
1 mM
20
10
20
10
1,5 mM
2 mM
2,5 mM
3 mM
0 0
0 0 2000 2000 4000 4000 6000 6000
Zeit (s) Zeit (s)
Abbildung 5.14: Spaltungsaktivität von GST-hAgo2 bei verschiedenen MgCl 2 -Konzentrationen (siehe
Abschnitt 4.4.1). Nach einer Präinkubation ohne EDTA (A) oder mit 1 mM EDTA (B) wurde ein
Standard-Spaltungsassay mit 3,7 µM GST-hAgo2 mit anschlieÿender denaturierender PAGE durchgeführt
und mittels Autoradiographie detektiert. (C) Quantizierung des maximalen target RNA-
Umsatzes in Abhängigkeit von verschiedenen MgCl 2 -Konzentrationen. t: Zeit. IVT: ICAM-1 in vitro
Transkript als target RNA.
109