Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

elative Fluoreszenz
k 1, obs (s -1 )
5.8 Charakterisierung der target RNA-Bindung durch den binären hAgo2/guide RNA-Komplex
GST
hAgo2
A
7
6
5
4
6
5,8
5,6
5,4
5,2
5
4,8
B
50
40
30
3
4,6
0 0,2 0,4 0,6 0,8
20
2
1
10
0
0 200 400 600 800 1000
Zeit (s)
0
0 20 40 60 80
s2B-BHQ (nM)
Abbildung 5.33: Pre-steady state Assoziationskinetik von binärem GST-hAgo2/P-as2B-FAM-
Komplex und s2B-BHQ als target RNA (siehe Abschnitt 4.4.3). (A) Repräsentative stopped ow Messung
der Bildung des ternären Komplexes aus 20 nM P-as2B-FAM sowie 600 nM GST-hAgo2 und 50 nM
s2B-BHQ. Die Daten wurden mit einer dreifach exponentiellen Gleichung ausgewertet und ergaben
k 1, obs = 25,7 (± 1,9) s -1 , k 2 = 0,0123 (± 0,00004) s -1 und k 3 = 0,0054 (± 0,00005) s -1 . (B) Abhängigkeit
von k 1, obs u. a. aus (A) von der s2B-BHQ-Konzentration. Es ergab sich k 1 = 2,8 (± 0,47) × 10 8 M -1 s -1
und k -1 = 11,8 (± 2,0) s -1 .
te pseudo-erster Ordnung (k 1, obs ). Sie ist linear abhängig von der target RNA-Konzentration
(siehe Abbildung 5.33 B), woraus sich k 1 = 2,8 (± 0,47) × 10 8 M -1 s -1 ergibt. Analog zur Bildung
des binären Komplexes (siehe Abschnitt 5.7.3) repräsentiert diese konzentrationsabhängige
Phase aller Wahrscheinlichkeit nach die diusionskontrollierte Bildung eines Kollisionskomplexes.
Die Dissoziationsratenkonstante wurde näherungsweise aus dem Ordinatenabschnitt
bestimmt und ergab k -1 = 11,8 (± 2,0) s -1 .
Die zweite und dritte Phase sind konzentrationsunabhängig und besitzen kleinere Ratenkonstanten
(k 2 = 0,0131 (± 0,0019) s -1 und k 3 = 0,0048 (± 0,0009) s -1 , Mittelwerte aus fünf unabhängigen
Experimenten). Vermutlich handelt es sich bei diesen Phasen um konformationelle
Umlagerungen während der Assemblierung des ternären Komplexes zur Ausbildung einer katalytisch
kompetenten Einheit.
Die Assoziation der ternären Komplexe wurde weiterhin mit den beiden anderen experimentellen
Ansätzen (siehe Abschnitt 5.8.1) untersucht. Es wurden jeweils 20 nM guide RNA mit
600 nM GST-hAgo2 gemischt und für 15 min bei 25 ◦ C inkubiert, so dass sich binäre Komplexe
bildeten. Anschlieÿend wurden diese rasch mit 20 nM der jeweiligen target RNA gemischt und
die Fluoreszenzsignalzunahme beobachtet. Die Daten wurden mathematisch mit Hilfe einer
exponentiellen Gleichung ausgewertet. Mit beiden Systemen konnten die bereits gewonnenen
Ergebnisse zur Assoziation ternärer Komplexe bestätigt werden (siehe Tabelle 5.3).
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