Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

% Umsatz
% Umsatz
1/ k
k (s -1 )
5 Ergebnisse
zugefügt. Nach Beendigung der Reaktion zu den gewünschten Zeitpunkten, Trennung der Ansätze
mittels Sequenziergel und anschlieÿender Autoradiographie wurden die ermittelten target
RNA-Umsätze gegen die Zeit aufgetragen. Die mathematische Auswertung der experimentellen
Daten erbrachte einen maximalen Umsatz von 29,1 (± 6,0) % bei einer Ratenkonstanten
von 0,0002 (± 0,00006) s -1 . Somit konnte die durch eine doppelsträngige siRNA vermittelte
target RNA-Spaltung durch GST-hAgo2 reproduziert werden.
5.9.3 Michaelis-Menten-Kinetik der Spaltungsreaktion
Für eine kinetische Charakterisierung des target RNA-Umsatzes durch einen binären GSThAgo2/P-as2B-Komplex
wurde die Spaltung von ICAM-1-IVT in Abhängigkeit von der guide
RNA-Konzentration untersucht. Es wurden je 2,5 µM GST-hAgo2 mit 2,5 nM target RNA und
15 400 nM P-as2B als limitierenden Faktor für die Bildung binärer Komplexe inkubiert. Die
Ratenkonstante jeder Reaktion wurde mit Hilfe einer exponentiellen Gleichung ermittelt (siehe
Abbildung 5.38 A) und gegen die Konzentration von binärem Komplex aufgetragen. Es ergab
sich für V max = 0,0009 (± 0,0002) nMs -1 und für K m = 21,4 (± 13,1) nM (siehe Abbildung 5.38
B).
GST
hAgo2
A
15
B
0,001
0,0008
15
10
5
10
5
400 nM P-as2B
0
0 1000 2000 3000 4000
Zeit (s)
0
0 1000 2000 3000 4000
15 nM P-as2B
90 nM P-as2B
250 nM P-as2B
0,0006
0,0004
0,0002
3000
2000
1000
0
0 0,02 0,04 0,06
1/binärer Komplex
0
0 100 200 300 400 500
binärer Komplex (nM)
Abbildung 5.38: Michaelis-Menten-Kinetik der guide RNA-vermittelten Spaltungsreaktion von target
RNA durch GST-hAgo2 (siehe Abschnitt 4.4.1). (A) Mathematische Auswertung der target RNA-
Spaltung durch 2,5 µM GST-hAgo2 und 15 400 nM guide RNA zur Ermittlung der korrespondierenden
Ratenkonstanten. (B) Die ermittelten Ratenkonstanten wurden gegen die Konzentration des
Zeit (s)
binären Komplexes aufgetragen und V max = 0,0009 (± 0,0002) nMs -1 sowie K m = 21,4 (± 13,1) nM ermittelt.
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