Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
5.11.3 Zusammenfassung der biochemischen und kinetischen Parameter
bei der Bildung eines hTRBP-His/siRNA-Komplexes
Für eine vergleichende Übersicht sind die Ergebnisse zur Bindung von siRNA durch hTRBP-
His an dieser Stelle tabellarisch aufgeführt.
siRNA-Substrat
K d (nM) k 1 k -1 k 2 k -2
FT ber. (M -1 s -1 ) (s -1 ) (s -1 ) (s -1 )
FAM-siLam 1,5 1,0 * 1,9 × 10 8 3,2 2,6 0,15
Tabelle 5.5: Übersicht über die biochemischen und kinetischen Parameter bei Bildung eines hTRBP-
His/siRNA-Komplexes. Mittels Gleichgewichts-Fluoreszenztitration (FT) experimentell bestimmte
oder berechnete (ber.) Dissoziationskonstanten sowie Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten
für die Bildung eines Komplexes aus hTRBP-His und siRNA. * Für die Berechnung der Dissoziationskonstante
wurde der direkt mittels Verdrängungsexperiment ermittelte Wert für k -1 verwendet.
5.12 Untersuchung des Einusses von hTRBP auf die
siRNA-vermittelte target RNA-Spaltung 8
In Abschnitt 5.11 konnte gezeigt werden, dass hTRBP doppelsträngige siRNA bindet. Weiterhin
gelang in Abschnitt 5.9.2 die target RNA-Spaltung durch hAgo2, nachdem dieses mit
doppelsträngiger siRNA programmiert worden war. Diese beiden Voraussetzungen schufen die
Möglichkeit, den Einuss von hTRBP-His auf die siRNA-vermittelte target RNA-Spaltung
durch hAgo2 zu untersuchen. Als Abschluss dieser Arbeit wurden initiale Experimente durchgeführt,
um diese Fragestellung zu untersuchen.
Es wurde ein modizierter Spaltungsassay durchgeführt, bei dem in 1 × Ago-Bindungspuer
3,7 µM GST-hAgo2 mit 100 nM P-si2B und 2,5 nM radioaktiv markierter s2B als target RNA in
Anwesenheit von 1 µg/µl tRNA inkubiert wurde. In einem parallelen Ansatz wurde die siRNA
zuvor mit 3,7 µM hTRBP-His für 8 min bei 25 ◦ C präinkubiert, bevor beide Komponenten mit
dem restlichen Spaltungsansatz gemischt wurden, um die Bindung der siRNA an hTRBP-His
zu erlauben. Nach 8 min wurde in beiden Fällen die Reaktion durch Zugabe von 0,5 mM MgCl 2
gestartet. Das weitere Verfahren entsprach einem Standard-Spaltungsassay (siehe Abschnitt
4.4.1). Das Ergebnis ist in Abbildung 5.48 dargestellt.
Es zeigte sich, dass in Ab- und Anwesenheit von hTRBP-His Spaltung von target RNA
durch hAgo2 stattndet und diese durch siRNA vermittelt wird (siehe Abbildung 5.48 A).
Dieses Ergebnis erwies sich als reproduzierbar. Die Banden der Produkte weisen im ersten
Fall eine Länge von 9 nt auf und entsprechen damit dem erwarteten Produkt. Im zweiten
Fall nden sich neben dem kanonisch gespaltenen Produkt eine Bande geringerer und zwei
8 Die in Abschnitt 5.12 beschriebenen Experimente wurden in Zusammenarbeit mit S. Willkomm und J.
Heidemann im Rahmen der Betreuung ihrer Master- bzw. Bachelorarbeit durchgeführt.
160