Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

2.3 Die Familie der Argonaute Proteine
in denen das erste Nukleotid des guide Stranges in die Erkennung und Bindung der target
RNA nicht involviert ist [63, 82, 156]. Durch die Verankerung des guide Stranges und die
Bildung von Watson-Crick-Basenpaarungen mit der target mRNA wird diese an denierter
Stelle gespalten. Die Mid Domäne ist also Teil des intrinsischen molekularen Lineals von Ago
Proteinen.
In N. crassa QDE-2 wurde eine zweite Tasche identiziert, die putativ an ein allosterisch
wirkendes Nukleotid binden kann [129]. Allosterische Regulation der RNA-Bindung wurde
bereits früher beobachtet [157] und wird in der Literatur kontrovers diskutiert.
Strukturelle Analysen der Mid Domäne von hAgo2 haben ergeben, dass über den rigiden
nucleotide specicity loop (NSL) mittels des Peptidrückgrates zwischen den vier möglichen Nukleotiden
am 5'-Ende des guide Stranges diskriminiert wird (siehe Abbildung 2.5 C). Dieses
Motiv ist bei QDE-2, dem homologen Protein aus N. crassa, um eine Aminosäure verlängert
und trägt nicht zur Substratselektivität bei [128, 129, 158]. In A. thaliana werden bestimmte
kleine regulatorische RNAs auf Grund ihrer verschiedenen 5'-Nukleotide auf distinkte Ago Proteine
geladen [159, 160]. Die Diskriminierung zwischen verschiedenen Substraten erönet die
Möglichkeit zur Spezialisierung eines oder mehrerer Ago Proteine innerhalb des Organismus.
Über die Mid Domäne werden einige vom slicing unabhängige Funktionen vermittelt. In S.
pombe bildet das im RITS Komplex enthaltene Protein Tas3 den Ago Haken, mit dem es an
die Mid Domäne bindet, was zum eektiven TGS führt. Die verantwortlichen Aminosäuren
sind im Menschen konserviert [161]. Auÿerdem enthält die Mid Domäne einen konservierten
Bereich, der Homologie zum m 7 G cap Bindemotiv von eIF4E aufweist. Es wird diskutiert, ob
Ago um die mRNA-Bindung mit eIF4E in Kompetition treten und dadurch sequenzspezisch
die Translation hemmen kann [55, 158, 162].
2.3.5 Die P-element induced wimpy testis (PIWI) Domäne
Die C-terminale PIWI Domäne (siehe Abbildung 2.6 A) vermittelt die katalytische Funktion
von hAgo2. Ihre Faltung erinnert an die RNase H [26, 27, 62, 164], eine zelluläre Endonuklease,
die DNA-RNA-Hybride erkennt und die RNA-Komponente spaltet [165]. Wie bei der RNase
H bilden drei distinkte Aminosäuren die Katalytische Triade: D597, D669, H807 [26, 62].
Auÿerdem sind beide Enzyme von Mg 2+ abhängig und generieren typische Spaltprodukte mit
5'-Phosphat- und 3'-Hydroxyl-Termini (siehe Abbildung 2.6 B) [163, 166168].
Der hydrophobe C-Terminus des Proteins ist an der Kontaktäche von Mid und PIWI Domäne
lokalisiert. Er trägt zur Bindung des 5'-Endes des guide Stranges bei (siehe Abschnitt
2.3.4). Die kürzlich publizierte Röntgenkristallstruktur des die Mid und PIWI Domäne enthaltenden
Lappens von QDE-2 aus N. crassa enthüllte die Existenz zweier α-Helices innerhalb
der PIWI Domäne, die in prokaryoten Agos bisher nicht entdeckt worden waren. Sie umfassen
die Aminosäuren K901 G925. Es wird diskutiert, ob diese C-terminale Insertion bei bestimmten
Proteinkonformationen Kontakt zur PAZ Domäne herstellen und dadurch als Sensor für
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