Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

Fluoreszenz
relative Fluoreszenz
5.11 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hTRBP
hTRBP
H
A
8500
B
1,4
8000
1,3
7500
1,2
7000
1,1
6500
0 100 200 300 400
hTRBP-His (nM)
1
0 100 200 300 400 500 600
siLam (nM)
Abbildung 5.45: Bestimmung der Afnität von hTRBP-His zu endständig markierter doppelsträngiger
siRNA (siehe Abschnitt 4.4.2). (A) Titrationskurve einer Gleichgewichts-Fluoreszenztitration von
30 nM FAM-siLam mit steigenden Konzentrationen hTRBP-His. Die Auswertung der Daten erfolgte
mit einer quadratischen Bindungsgleichung und ergab K d = 1,5 (± 0,61) nM. (B) Titrationskurve einer
Verdrängungstitration eines Komplexes aus 30 nM FAM-siLam und 400 nM hTRBP-His mit steigenden
Konzentrationen unmarkierter siLam. Die Auswertung der Daten erfolgte durch ein iteratives
Verfahren und ergab K d = 1,0 (± 0,11) nM für die unmarkierte siLam.
gleichung ergab sich K d = 1,5 (± 0,61) nM (siehe Abbildung 5.45 A). Diese Gleichgewichts-
Dissoziationskonstante unterscheidet sich deutlich von derjenigen mittels si2B-FAM gemessenen
(K d = 126,8 nM für si2B-FAM versus K d = 1,5 nM für FAM-siLam), was ein weiterer
Hinweis darauf ist, dass die Position des Fluorophors bei dem Substrat si2B-FAM einen inhibierenden
Einuss auf die Bindungsreaktion mit hTRBP-His ausübt.
Es wurde eine Verdrängungstitration durchgeführt, bei dem zu einem Komplex aus 30 nM
FAM-siLam und 400 nM hTRBP-His schrittweise siLam hinzu titriert wurde. Die Titrationskurve
wurde durch ein iteratives Verfahren mit Hilfe des Programms Scientist ausgewertet
(siehe Anhang A.1.2). Für das unmarkierte Substrat siLam ergab sich hieraus als
Gleichgewichts-Dissoziationskonstante K d = 1,04 (± 0,11) nM (siehe Abbildung 5.45 B). Da
sich die Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten für markiertes und unmarkiertes siLam kaum
unterscheiden (K d = 1,5 nM für FAM-siLam versus K d = 1,0 nM für siLam), scheint die endständig
an die siRNA gekoppelte FAM-Markierung keinen Einuss auf die Bindungsreaktion
zwischen hTRBP-His und dieser siRNA zu besitzen.
5.11.2 Kinetik der Bindungsreaktion von hTRBP und siRNA
Da sich FAM-siLam als ein Bindungspartner herausgestellt hat, bei dem die Reaktion nicht
durch das Fluorophor beeinusst wird (siehe Abschnitt 5.11.1), wurden die Untersuchungen
der Bindungsreaktion unter pre-steady state Bedingungen mit FAM-siLam durchgeführt. Zur
Abtrennung groÿer Aggregate wurde hTRBP-His für 1 h bei 4 ◦ C und 150.000 × g zentrifugiert
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