Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.5 Biochemische Charakterisierung von rekombinantem hAgo2
Molekulargewicht von 99,0 bzw. 98,5 kDa ergibt sich also, dass zum Teil Oligomere aus 13 oder
mehr hAgo2-Molekülen vorliegen. Beim Konstrukt GST-hAgo2 hatte sich ein ähnliches Bild
gezeigt. Es besitzt ein Molekulargewicht von 124,3 kDa, woraus sich errechnen lässt, dass die
sich im Ausschlussvolumen bendlichen Proteinmultimere mindestens zehn Monomere umfassen.
Mit Hilfe von analytischer Gelltration lässt sich jedoch nur näherungsweise bestimmen,
welche hAgo2-Populationen vorliegen. Eine genaue Aussage über den Oligomerisierungsgrad
(Monomere bzw. verschiedene Oligo- bis Multimere) ist nicht machbar. Weiterhin kann mit
dieser Methode nicht bestimmt werden, welche Population welchen Anteil der Gesamtproteinmenge
ausmachen.
Untersuchung mittels Dynamischer Lichtstreuung
Nachdem eine Untersuchung mittels analytischer Gelltration nur eine vage Aussage über
die hAgo2-Populationen und deren Zusammensetzung in einer Lösung zulässt, wurden im
Folgenden mit Hilfe von Dynamischer Lichtstreuung detaillierte Studien mit dem Konstrukt
NHA-hAgo2 durchgeführt. Dabei wurden hauptsächlich durch zwei Gröÿen Informationen
über die Proteinlösung gewonnen. Zum Einen konnten über ein Regularisierungs-Histogramm
die verschiedenen Populationen in der hAgo2-Lösung auf Grund ihrer unterschiedlichen hydrodynamischen
Radien ermittelt und ihr Anteil an der Gesamtmasse sowie ihre Polydispersität
bestimmt werden. Dies diente beispielsweise der Identikation einer enzymatisch aktiven Population.
Zum anderen wurde der durchschnittliche hydrodynamische Radius aller Populationen
in einer Messung ermittelt und die Veränderung durch diverse Faktoren beobachtet. Hierüber
lieÿen sich Aussagen über das Aggregationsverhalten von hAgo2 in Abhängigkeit von Pufferbestandteilen,
Inkubationszeiten und -temperaturen und den Einuss von Nukleinsäuren
beobachten.
Zunächst wurde der Oligomerisierungsgrad von NHA-hAgo2 in seinem Lagerpuer (siehe
Abschnitt 4.3.8) untersucht. Unter der Annahme, dass hAgo2 ein globuläres Protein ist,
beträgt sein berechneter hydrodynamischer Radius 4,3 nm. Abweichungen von diesem idealen
Wert sind bei DLS-Messungen jedoch nicht ungewöhnlich. So beträgt der berechnete hydrodynamische
Radius von BSA 3,6 nm und konnte experimentell auf 2,8 3,5 nm bestimmt werden.
Abbildung 5.15 zeigt ein typisches Regularisierungs-Histogramm einer NHA-hAgo2-Lösung.
In der Lösung zeigen sich innerhalb des Messbereiches der DLS-Apparatur von 1 1000 nm
drei individuelle Populationen, wobei alle als gering polydispers eingestuft werden können. Population
1 hat mit 79,4 % den gröÿten Anteil an der Gesamtproteinmenge und kann durch den
hydrodynamischen Radius von 7,6 nm als vermutlich mono- bis tetramer identiziert werden.
Bei den anderen beiden Populationen handelt es sich wahrscheinlich um gröÿere Aggregate.
Neben diesen drei Signalen können zwei weitere verzeichnet werden, die jedoch auÿerhalb des
verlässlichen Messbereiches der DLS-Apparatur liegen. Ein Signal mit einem hydrodynami-
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