Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

% Umsatz
5 Ergebnisse
Einsatz der kompetierenden Poly-A-RNA unterbunden wird. Hierzu wurden 3,7 µM GSThAgo2
mit 100 nM P-as2B und 2,5 nM radioaktiv markiertem ICAM-1-IVT in 1 × Ago-
Bindungspuer für ca. 15 min bei 25 ◦ C inkubiert. Zum Reaktionsstart wurden 0,5 mM MgCl 2
sowie 45 µM Poly-A-RNA zugegeben. Die Reaktion wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gestoppt
und die Ansätze durch ein denaturierendes Sequenziergel aufgetrennt. In einem Kontrollansatz,
bei dem keine Poly-A-RNA zugesetzt worden war, war Umsatz der target RNA
beobachtbar. Im Gegensatz dazu konnte bei Einsatz der kompetierenden RNA kein Umsatz
detektiert werden. Aus diesem Ergebnis lässt sich schlieÿen, dass die Kompetition radioaktiv
markierter target RNA mit der nicht radioaktiven Poly-A-RNA erfolgreich war. Vermutlich ist
die Konzentration der initial gebildeten Komplexe und dadurch die Spaltung der target RNA
so gering, dass sie mit dem verwendeten System nicht zu detektieren war.
Zur Optimierung des Experiments wurde die Konzentration von hAgo2 auf 14,8 µM und der
guide RNA auf 240 nM erhöht, um eine gröÿere Konzentration von aktiven binären Komplexen
zu erhalten, die initial die target RNA binden können. Weiterhin wurde die target RNA-
Konzentration von 2,5 nM auf 240 nM erhöht, um die Detektionsgrenze der mittels Autoradiographie
visualisierten RNA-Banden im Sequenziergel zu überschreiten. Das erneut durchgeführte
Experiment zeigte jedoch ebenfalls keinen Erfolg (siehe Abbildung 5.40). Zwar konnte
nun auch bei Einsatz der kompetierenden Poly-A-RNA ein target RNA-Umsatz detektiert
werden, jedoch ist die Amplitude der Spaltung zu gering. Eine mathematische Auswertung
GST
hAgo2
A
+ + + + +
+ + + + +
+ + + + +
+ + + + +
+ +
+ +
+ +
- -
GST-hAgo2
target RNA
guide RNA
Poly-A
B
0,5
t (min)
0,4
IVT (140 nt)
0,3
0,2
0,1
5’-Spaltprodukt
(87 nt)
0
0 1000 2000 3000 4000
Zeit (s)
Abbildung 5.40: Spaltungsaktivität präassemblierter ternärer Komplexe in An- und Abwesenheit
kompetierender RNA. Durchführung siehe Text. (A) Spaltungsassay mit 14,8 µM GST-hAgo2, 240 nM
P-as2B und 240 nM ICAM-1-IVT nach Präassemblierung mit anschlieÿender denaturierender PAGE
und Detektion mittels Autoradiographie. (B) Die ermittelten Umsätze wurden gegen die Zeit aufgetragen,
jedoch ist der Gesamtumsatz von 0,4 % zu gering für eine mathematische Auswertung. t: Zeit.
IVT: ICAM-1 in vitro Transkript als target RNA.
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