Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.7 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hAgo2
(± 0,0004) s -1 ermittelt.
Auch die drei Dissoziationsratenkonstanten sollten einem biologischen Prozess zugeordnet
werden. Für die Rückreaktion der ersten Phase, die dem Zerfall eines Kollisionskomplexes
entspricht, konnten die bereits durch die Konzentrationsabhängigkeit der ersten Assoziationsphase
ermittelten Dissoziationskonstanten k -1 (für NHA-hAgo2 und P-as2B-FAM:
6,2 (± 0,62) s -1 und für NHA-hAgo2 und P-as2B-FAM: 5,5 (± 3,3) s -1 ) herangezogen werden.
Sie waren vergleichbar zu den in diesem Verdrängungsexperiment ermittelten Ratenkonstanten
k -1 = 14,7 (± 2,5) s -1 für NHA-hAgo2 und P-as2B-FAM bzw. k -1 = 10,9 (± 15,9) s -1 für NHAhAgo2
und OH-as2B-FAM. Trotz der bereits oben beschriebenen Ungenauigkeit der ersten
Methode weichen die jeweiligen Ratenkonstanten nur etwa um einen Faktor 2 voneinander ab.
Die Phase 2 der Dissoziation von NHA-hAgo2 und OH-as2B-FAM ist 10-fach schneller als
diejenige von NHA-hAgo2 und P-as2B-FAM. Da die beiden Substrate sich nur durch die
5'-Phosphatgruppe voneinander unterscheiden, muss dies folglich auch der Grund für die unterschiedliche
Dissoziationsratenkonstante sein. Die zweite Phase der Assoziation wurde einer
konformationellen Umlagerung während der Verankerung des 5'-Endes des guide Stranges in
der Mid Bindetasche zugeordnet. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die zweite Phase der Dissoziation
dem umgekehrten Prozess entspricht, also die Freisetzung des 5'-Endes repräsentiert.
Dies würde bedeuten, dass eine guide RNA ohne 5'-Phosphatgruppe schlechter in hAgo2 verankert
werden kann.
Somit kann postuliert werden, dass die dritte Dissoziationsphase eine konformationelle Änderung
des binären Komplexes repräsentiert, die für die Freisetzung des 3'-Endes des guide
Stranges aus der PAZ Domäne notwendig ist. Diese Vermutung konnte durch spätere Analysen
während der Assoziation eines ternären Komplexes aus GST-hAgo2, P-as2B-FAM und dem
als target RNA fungierenden s2B-BHQ erhärtet werden (siehe Abschnitt 5.8.3).
Ausgehend von den Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten (es wurden jeweils die
direkt mittels Verdrängungsexperiment ermittelten Werte für k -1 verwendet) konnte anhand
folgender Gleichung die Dissoziationskonstante berechnet werden:
K d = ∏ k -n
k n
(5.1)
Für den Komplex aus NHA-hAgo2 und P-as2b-FAM ergab sich K d = 37 nM und für den Komplex
aus NHA-hAgo2 und OH-as2b-FAM K d = 864 nM. Die Abweichung dieser Werte von
denjenigen durch Gleichgewichts-Fluoreszenztitration ermittelten lässt sich teilweise durch
die langsame Diusion der groÿen binären Komplexe erklären. Bei der Fluoreszenztitration
unter Gleichgewichtsbedingungen fällt diese Verzögerung nicht ins Gewicht, da die Messung
des Fluoreszenzsignals erst nach Ende der Komplexbildung erfolgt. Bei den Messungen unter
pre-steady state Bedingungen hingegen führt die zeitliche Abhängigkeit der Messung dazu,
dass die Diusionsprozesse eine Rolle spielen. Neben der Gröÿe der binären Komplexe muss
auch bedacht werden, dass es auf Grund der Aggregationsneigung von hAgo2 zur Bildung von
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