Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5 Ergebnisse
FAM
P
BHQ
2h
25°C
FAM
P
BHQ
+
100 x
3h
25°C
FAM
P
+
+
BHQ
Abbildung 5.41: Schema des experimentellen Aufbaus zur Untersuchung der Produktfreisetzung
nach target RNA-Spaltung durch hAgo2. Nach schrittweiser Assemblierung von binärem und ternärem
Komplex unter Beobachtung der jeweiligen Fluoreszenzabnahme kam es zur Bildung von target
RNA-Spaltprodukten. Durch Zugabe von 100-fachem Überschuss guide RNA zur Kompetition des
binären Komplexes wurden die aus dem ternären Komplex dissoziierenden Spaltprodukte gebunden.
Der Prozess konnte anhand der Signalzunahme bei räumlicher Trennung von Fluorophor FAM und
Fluoreszenzlöscher BHQ beobachtet werden. Für Sequenzen siehe Abschnitt 3.8.2.
Die Ratenkonstanten aller Reaktionen sind gleich, weshalb angenommen werden kann, dass
die Spaltungsreaktionen nach demselben Mechanismus ablaufen.
Es muss bei der Messung der Reaktionsgeschwindigkeit der Produktfreisetzung also davon
ausgegangen werden, dass zwei Populationen von ternären Komplexen vorliegen: solche, die
aus GST-hAgo2, guide RNA und gespaltener target RNA bestehen und solche, bei denen keine
target RNA-Spaltung erfolgt ist (siehe Abschnitt 5.10.2). Dieser Sachverhalt würde allerdings
auch im Fall einer vollständigen target RNA-Spaltung gelten, da die Dissoziation der Spaltprodukte
bereits während der Spaltungsreaktion auftritt und unter den vorliegenden multiple
turnover Bedingungen neue target RNA von den binären Komplexen gebunden wird.
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