Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
Komponente Sammelgel Trenngel
Trennbereich Prozentigkeit
Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1, v/v) 5 % (v/v) 50 350 kDa 6 % (v/v)
30 300 kDa 8 % (v/v)
20 250 kDa 10 % (v/v)
10 200 kDa 12 % (v/v)
3 100 kDa 15 % (v/v)
Tris-HCl (pH 8,8) 125 mM
Tris-HCl (pH 6,8) 375 mM
SDS 0,1 % (w/v) 0,1 % (w/v)
APS 0,1 % (w/v) 0,1 % (w/v)
TEMED 0,1 % (v/v) 0,06 % (w/v)
Tabelle 4.8: Zusammensetzung von Sammel- und Trenngel sowie Prozentigkeit des Trenngels in
Abhängigkeit vom Trennbereich.
4.3.4 Detektion von Proteinen in Elektrophoresegelen und auf
PVDF-Membranen
Coomassie-Färbung
Der Triphenylmethanfarbsto Coomassie-Brilliantblau R 250 färbt Proteine unspezisch durch
Anlagerung an basische Aminosäure-Seitenketten. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt
bei ca. 100 ng Protein pro Bande.
Für die Visualisierung von Proteinen wurden SDS-Gele (siehe Abschnitt 4.3.3) oder PVDF-
Membranen (siehe Abschnitt 4.3.5) für 1 24 h bei Raumtemperatur in Coomassie-Färbelösung
geschwenkt und anschlieÿend in Coomassie-Entfärbelösung inkubiert (siehe Abschnitt 3.6), bis
ein optimales Signal/Hintergrund-Verhältnis erreicht wurde. Durch die in beiden Lösungen
enthaltene Essigsäure wurden die Proteine gleichzeitig xiert. Gele wurden für 1 h bei 80 ◦ C
unter Vakuum getrocknet und zu Dokumentationszwecken digitalisiert.
Ponceau S-Färbung
Alternativ zur Färbung mit Coomassie-Brilliantblau R 250 wurden Proteine auf PVDF-Membranen
mit dem Azofarbsto Ponceau S visualisiert, der an die positiv geladenen Aminogruppen
von Proteinen bindet. Diese Methode bietet den Vorteil, dass die Färbung vollständig
reversibel ist und im Anschluss eine Immundetektion durchgeführt werden kann. Somit eignet
sich die Ponceau S-Färbung als Kontrolle für den Elektrotransfer von Proteinen.
PVDF-Membranen (siehe Abschnitt 4.3.5) wurden für ca. 10 min bei Raumtemperatur in
Ponceau S-Färbelösung (siehe Abschnitt 3.6) geschwenkt und anschlieÿend mit H 2 O bis zum
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