Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.4 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hTRBP
Sequenzspezische Spaltung von target RNA Der katalytische Schritt der Gesamtreaktion
erinnert an denjenigen der hRNase H1. Eine entsprechende Ratenkonstante k 7 konnte
nicht bestimmt werden (siehe Abschnitt 5.9.1 und 5.9.4).
Freisetzung von target RNA-Spaltprodukten Dies stellt nach derzeitiger Datenlage
den limitierenden Faktor bei multiplem Umsatz dar. Die hierzu ermittelte Ratenkonstante
k 8 ist unter Abschnitt 5.10 aufgeführt. Die Freisetzung resultiert in der Regeneration des binären
hAgo2/guide RNA-Komplexes, sodass eine weitere target RNA gebunden und gespalten
werden kann.
6.4 Charakterisierung der siRNA-Bindung durch hTRBP
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand darin, Erkenntnisse über die Funktion von hTRBP
zu gewinnen. Die Rolle dieses dsRNA-bindenden Proteins innerhalb der RNAi ist bislang
nur im Ansatz verstanden. Die verminderte Genregulation in hTRBP-dezienten Zellen ist
jedoch ein aussagekräftiger Hinweis, dass hTRBP eine wichtige Rolle innerhalb der RNAi
spielt [79, 216, 234, 235]. Es wird vermutet, dass hTRBP als Mediator von Initiations- und
Eektorschritten der RNAi dient.
Seine Anität für dsRNA macht es wahrscheinlich, dass diese Eigenschaft die Funktion
von hTRBP innerhalb der RNAi vermittelt, da diese sehr stark von doppelsträngigen RNA-
Molekülen abhängig ist. Als Basis für funktionelle Untersuchungen wurde deshalb zunächst die
siRNA-Bindung durch hTRBP-His charakterisiert. In Analogie zu den biochemischen und kinetischen
Studien der RNA-Bindung durch hAgo2 wurden Substratbindungsparameter unter
Gleichgewichtsbedingungen ermittelt und im Anschluss die Bindungsreaktion transientenkinetisch
in Bezug auf die Anzahl der Phasen charakterisiert sowie die zugehörigen Assoziationsund
Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten bestimmt. Im Anschluss wurden erste Experimente
zur Untersuchung des Einusses von hTRBP-His auf die siRNA-vermittelte target
RNA-Spaltung durch hAgo2 durchgeführt.
6.4.1 hTRBP bindet siRNA mit hoher Anität
Für die siRNA-Bindungsstudien wurden zwei verschiedene Substrate verwendet, die deutlich
unterschiedliche Anitäten ergaben. Im Fall der intern markierten si2B-FAM betrug
K d = 126,8 nM, für die endständig markierte FAM-siLam wurde K d = 1,6 nM ermittelt. In
folgenden Experimenten konnte gezeigt werden, dass das Fluorophor bei der falschen Positionierung
vermutlich einen hemmenden Einuss auf die Assoziation der siRNA mit hTRBP-His
besitzt und deshalb zu einem etwa 100-fach höheren K d führt. Jedoch konnte mit diesem
Substrat in Gelverzögerungs-Analysen (siehe Abschnitt 5.6.2) und mittels Gleichgewichts-
Fluoreszenztitration (siehe Abschnitt 5.11.1) gezeigt werden, dass hTRBP-His einzelsträngige
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