Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.10 Charakterisierung der Produktfreisetzung nach target RNA-Spaltung
der experimentellen Daten war nicht möglich. Weitere Experimente zeigten, dass sowohl eine
stärkere Erhöhung der GST-hAgo2-Konzentration als auch der der target RNA zu Aggregation
führte. Deshalb ist die Etablierung eines sensitiveren Systems oder die drastische Steigerung
des single turnover Umsatzes notwendig, um die präliminären Daten aus Abschnitt 5.9.1 zu
bestätigen und eine robuste Geschwindigkeitsratenkonstante der Phosphodiesterhydrolyse zu
ermitteln.
5.10 Charakterisierung der Produktfreisetzung nach target
RNA-Spaltung
5.10.1 Experimentelles System zur Untersuchung der Freisetzung von
Spaltprodukten
Da hAgo2 ein zum multiplen Umsatz fähiges Enzym ist, muss für die Regeneration des target
RNA-bindenden binären Komplexes nach der Phosphodiesterhydrolyse die Freisetzung der
Spaltprodukte erfolgen. Nach heutigem Kenntnisstand stellt dieser Prozess den geschwindigkeitsbestimmenden
Schritt der siRNA-vermittelten RNAi dar. In D. melanogaster Embryolysat
kann die Geschwindigkeit der Gesamtreaktion durch Zugabe von ATP zu einem in vitro
Spaltungsansatz um den Faktor 4 gesteigert werden [63]. Bei der Verwendung von rekombinantem
GST-hAgo2 statt einem Zelllysat konnte ATP die Reaktion nicht beschleunigen [62].
Es muss also im RISC eine Komponente geben, die ATP-abhängig die Spaltproduktfreisetzung
beschleunigt, und diese ist nicht identisch mit hAgo2.
Für die Untersuchung der Freisetzung von Spaltprodukten aus dem ternären Komplex
nach der Katalyse wurde erneut das uoreszenzbasierte System verwendet, das aus dem guide
Strang P-as2B-FAM und der target RNA s2B-BHQ besteht (siehe Abbildung 5.41). Ein
ternärer Komplex aus GST-hAgo2, P-as2B-FAM und s2B-BHQ wurde in Anwesenheit von
MgCl 2 inkubiert, um Spaltprodukte zu bilden. Durch Zugabe eines 100-fachen Überschusses
as2B wurden die aus dem ternären Komplex dissoziierenden Spaltprodukte gebunden und eine
Reassoziation ausgeschlossen. Dieser Prozess wurde durch die Zunahme des Fluoreszenzsignals
in Abhängigkeit der Zeit beobachtet.
Um die Spaltung von s2B-BHQ bei der beschriebenen experimentellen Anordnung zu testen,
wurden Spaltungsassays durchgeführt, bei denen s2B bzw. s2B-BHQ am 5'-Ende radioaktiv
markiert und als target RNA eingesetzt wurden. Als guide RNA wurde jeweils entweder P-as2B
oder P-s2B-FAM verwendet.
Es konnte gezeigt werden, dass Umsatz von s2B-BHQ stattndet, wenn P-as2B oder P-
as2B-FAM als guide Strang verwendet wurden (siehe Abbildung 5.42 A). In beiden Fällen
ist jedoch der maximale Umsatz geringer als der von s2B. Weil die enzymatische Aktivität
von GST-hAgo2 mit seiner Lagerung über mehrere Monate abnimmt, wurde der maximale
Umsatz von s2B-BHQ zu demjenigen von s2B ins Verhältnis gesetzt (siehe Abbildung 5.42 B).
151