Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

% Umsatz
% Umsatz
relativer Umsatz
relativer Umsatz
relativer Umsatz
relativer Umsatz
relativer Umsatz
relativer Umsatz
5.10 Charakterisierung der Produktfreisetzung nach target RNA-Spaltung
1
1
0,8
GST
0,8
hAgo2
1
0,6
A
90
B
1
1
0,6
0,8
0,4
80
0,8
0,4
0,6
0,2
50
40
30
20
10
70
60
50
40
30
20
10
0
0 2000 4000 6000 8000
guide RNA/target RNA
Kombination
P-as2B/
s2B
P-as2B-FAM/
s2B
P-as2B/
s2B-BHQ
P-as2B-FAM/
s2B-BHQ
Zeit (s)
max. Umsatz
(%)
84,9
(± 5,9)
58,4
(± 5,5)
7,6
(± 0,7)
1,2
(± 0,1)
k gesamt
(s -1 )
0,0005
(± 1 x 10 -4 )
0,0004
(± 9 x 10 -5 )
0,0002
(± 5 x 10 -5 )
0,0002
(± 4 x 10 -5 )
0,6
0,4
1
0,01
0,1
0,2
0
0,4
0,2
P-as2B/
guide RNA/target RNA Kombination
s2B
0,2
0
P-as2B/
P-as2B-FAM/
guide RNA/target RNA Kombination
0,1
s2B
s2B
0
P-as2B-FAM/ P-as2B/ P-as2B/
guide RNA/target RNA Kombination
s2B s2B s2B-BHQ
0,01
P-as2B/ P-as2B/ P-as2B-FAM/ P-as2B-FAM/
s2B s2B-BHQ s2B s2B-BHQ
P-as2B-FAM/ P-as2B-FAM/ P-as2B/
guide s2B RNA/target s2B-BHQ RNA s2B-BHQ Umsatz von s2B-BHQ
Kombination
P-as2B/
relativ zu s2B
P-as2B-FAM/
s2B-BHQ P-as2B/
s2B
P-as2B-FAM/
s2B-BHQ
1
s2B-BHQ P-as2B/
s2B-BHQ
0,09
P-as2B-FAM/
s2B
P-as2B-FAM/
s2B-BHQ
0
guide RNA/target RNA Kombination
1
0,02
0
0 2000 4000 6000 8000
Zeit (s)
Abbildung 5.42: target RNA-Umsatz bei Einsatz verschiedener Nukleinsäurekombinationen (siehe
Abschnitt 4.4.1). (A) Bei allen verwendeten Nukleinsäure-Kombinationen ndet sequenzspezische
Spaltung der jeweiligen target RNA mit vergleichbarer Rate, aber unterschiedlichem maximalen Umsatz
statt. (B) Balkendiagramm zur Darstellung des relativen Umsatzes von s2B-BHQ bei der P-as2Bbzw.
P-as2B-FAM-vermittelten target RNA-Spaltung. Die Werte wurden jeweils auf den Umsatz von
s2B normiert. s2B-BHQ wird unter Verwendung von P-as2B zu 9 % umgesetzt im Vergleich zu s2B.
Mit P-as2B-FAM als guide Strang wird s2B-BHQ im Vergleich zu s2B zu 2 % gespalten.
5.10.2 Kinetik der Spaltproduktfreisetzung
Zunächst wurden binäre Komplexe gebildet, indem 600 nM GST-hAgo2 mit 20 nM P-as2B-
FAM für 10 min bei 25 ◦ C in Ago-Spaltungspuer präinkubiert und die durch die Assoziation
verursachte Fluoreszenzabnahme mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrometers kontrolliert wurde.
Die Spaltungsreaktion wurde durch Zugabe von 20 nM s2B-BHQ gestartet, wodurch es
zeitgleich zur fast vollständigen Fluoreszenzlöschung kam. Es folgte eine Inkubation für 2 h
bei 25 ◦ C, um die Bildung von ternären Komplexen mit gebundenen Spaltprodukten zu ermöglichen.
Die Zugabe von 2000 nM as2B als Kompetitor des binären Komplexes führte zur
Bindung von aus dem ternären Komplex dissoziierenden BHQ-markierten Nukleinsäuren. Die
resultierende Fluoreszenzsignalzunahme wurde in Abhängigkeit der Zeit aufgezeichnet (siehe
Abbildung 5.43).
153