Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4 Methoden
4.1.6 Restriktionshydrolyse von DNA
Restriktionsendonukleasen sind bakterielle Enzyme, die eine spezische Nukleotidsequenz erkennen
und DNA an denierten Stellen hydrolysieren können. Sie wurden eingesetzt, um
Plasmid-DNA anhand eines Schnittmusters zu analysieren bzw. zu linearisieren oder zueinander
kompatible Enden von DNA-Fragmenten, wie PCR-Produkten, zu generieren und somit
für eine Ligation vorzubereiten. Je nach Sequenzkontext wurden adäquate Restriktionsenzyme
eingesetzt und die Hydrolyse bei 37 ◦ C nach Herstellerangaben im jeweils passenden Puersystem
durchgeführt. Im Anschluss wurden die Ansätze mittels Agarose-Gelelektrophorese (siehe
Abschnitt 4.1.3) aufgetrennt, die Banden unter UV-Licht visualisiert (siehe Abschnitt 4.1.4)
und ggf. für die weitere Verwendung extrahiert (siehe Abschnitt 4.1.5).
4.1.7 Herstellung elektrokompetenter E. coli Zellen
Für das Einbringen von Plasmid-DNA durch Elektroporation in verschiedene E. coli Stämme
mussten diese von Salzen befreit und ihre Membran durch Waschen mit einem Wasser/Glyzeringemisch
destabilisiert werden. Dazu wurde 1 l LB-Medium mit 15 ml einer Übernachtkultur
des entsprechenden E. coli Stammes auf eine initiale OD 600 von ca. 0,05 angeimpft und bis zu
einer OD 600 von 0,5 0,8 bei 37 ◦ C schüttelnd inkubiert. Die folgenden Schritte wurden auf Eis
bzw. bei 4 ◦ C und mit vorgekühlten Lösungen durchgeführt, um eine maximale Transformationsrate
zu erreichen. Zur Sedimentation der Zellen wurden diese für 20 min bei 5.000 × g und
4 ◦ C zentrifugiert und anschlieÿend 2 × in je 250 ml H 2 O gewaschen. Anschlieÿend wurden sie
in 20 ml 10 % (v/v) Glyzerin resuspendiert und für 30 min bei 5.000 × g und 4 ◦ C pelletiert.
Zuletzt wurden die Zellen in 1 ml 10 % (v/v) Glyzerin resuspendiert, in Aliquots von 90 µl
portioniert und in üssigem Sticksto schockgefroren. Die Lagerung elektrokompetenter E.
coli Zellen erfolgte bei 80 ◦ C.
4.1.8 Ligation von linearisierter Plasmid-DNA mit DNA-Oligonukleotiden
oder PCR-Produkten
Mit Hilfe der T4 DNA Ligase wurden DNA-Fragmente mit zueinander kompatiblen Enden (siehe
Abschnitt 4.1.6) verknüpft und somit Gene von Interesse in ein transformierbares Plasmid
eingebracht. Hierfür wurden in einem Ansatz 1 × Ligationspuer 100 ng eines linearisierten,
aus einem Agarosegel isolierten Plasmids (siehe Abschnitt 4.1.5) entweder mit äquimolaren
Mengen oder einem dreifachen Überschuss von Insert sowie 0,1 u T4 DNA Ligase gemischt und
für 6 h bei 22 ◦ C inkubiert. Anschlieÿend wurde die Ligase durch eine Inkubation für 10 min
bei 65 ◦ C inaktiviert.
Um die Menge an religiertem Plasmid ohne Insert zu ermitteln, wurde in einem weiteren
Ansatz linearisiertes Plasmid allein wie beschrieben behandelt.
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