Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

Weitere Magazine

Empfehlungen

Info

6 Diskussion Mid PIWI PAZ N hAgo2 P guide RNA Beladung von hAgo2 P P P hPACT P siRNA P hTRBP P target RNA Erkennung und Bindung der target RNA P Regeneration P P Katalyse P Abbildung 6.2: Modell der minimalen rekombinanten RNA-Interferenz. Erläuterungen siehe Text. 194
6.6 Ausblick einer konformationellen Umlagerung des ternären Komplexes, der vermutlich die Freisetzung des 3'-Endes der guide RNA zur Folge hat. Daraufhin können sich über den seed Bereich hinaus weitere Basen zwischen guide und target RNA paaren und es wird ein katalytisch kompetenter Komplex generiert. Katalyse Die endonukleolytische Spaltung erfolgt in Abhängigkeit der guide RNA-Sequenz am Phosphatrückgrat der target RNA gegenüber dem 10. und 11. Nukleotid des guide Stranges. Die Spaltung erfolgt nach Programmierung von hAgo2 mit einer einzelsträngigen oder doppelsträngigen siRNA. Regeneration Für einen multiplen Umsatz muss nach erfolgter Spaltung der target RNA der binäre Komplex regeneriert werden. Dies erfordert die Freisetzung der Spaltprodukte, was aller Wahrscheinlichkeit nach den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Gesamtreaktion darstellt. 6.6 Ausblick In dieser Arbeit ist es gelungen, ein kinetisches Modell der siRNA-vermittelten target RNA- Spaltung zu etablieren und die einzelnen beobachteten Schritte entsprechend zuzuordnen. Dennoch bleiben weiterhin viele Details dieses Prozesses ungenügend verstanden bzw. während der Arbeit an diesem Projekt sind weitere Fragen aufgetreten, die im Rahmen dieser Dissertation nicht beantwortet werden konnten. Im Folgenden werden einige davon aufgeführt. Das etablierte Expressions- und Reinigungssystem für GST-hAgo2 liefert im Milligramm- Maÿstab Protein mit sehr hoher Aktivität, was für in vitro Studien eine zwingende Voraussetzung darstellt. Der Reinheitsgrad konnte gegenüber dem zuvor verwendeten NHA-hAgo2 ebenfalls verbessert sowie die Stabilität erhöht werden. Allerdings stellen diese beiden Faktoren Reinheit und Stabilität nach wie vor die beiden gröÿten Hürden für die Handhabung des Proteins und somit auch für zukünftige Studien dar. Für eine eindeutige Zuordnung kinetischer Parameter zu konformationellen Umlagerungen ist es nötig, die Röntgenkristallstruktur von humanem Ago2 im Komplex mit verschiedenen Substraten zu lösen. Dieses Ziel ist bislang nicht erreicht. Wenn dies gelingen soll, muss das vorhandene Reinigungssystem weiter optimiert werden. Während der Arbeit zeigte sich, dass entgegen der bisher geltenden Meinung rekombinantes hAgo2 durch doppelsträngige siRNA programmierbar ist. Wie dieser Prozess genau vonstatten geht, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Weitere Experimente werden nötig sein, um den Mechanismus genauer zu untersuchen und die siRNA- Strangtrennungseigenschaften von hAgo2 besser zu verstehen. Es konnten ebenfalls erste Hinweise darauf gewonnen werden, dass hTRBP möglicherweise die Beladung von hAgo2 Dicerunabhängig erleichtert, wohingegen hPACT diese Eigenschaft nicht aufzuweisen scheint. Die 195
Seite 1:
Aus dem Institut für Molekulare Me
Seite 5 und 6:
Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassun
Seite 7 und 8:
4.3.3 Gelelektrophorese zur Analyse
Seite 9 und 10:
5.12 Untersuchung des Einusses von
Seite 11 und 12:
1 Zusammenfassung Die RNA-Interfere
Seite 13 und 14:
Summary RNA interference (RNAi) is
Seite 15 und 16:
2 Einleitung 2.1 Über die Bedeutun
Seite 17 und 18:
2.2 Genregulation durch RNA-Interfe
Seite 19 und 20:
2.2 Genregulation durch RNA-Interfe
Seite 21 und 22:
2.3 Die Familie der Argonaute Prote
Seite 23 und 24:
Seite 25 und 26:
Seite 27 und 28:
Seite 29 und 30:
Seite 31 und 32:
2.4 Die strukturellen und molekular
Seite 33 und 34:
2.4 Die strukturellen und molekular
Seite 35 und 36:
2.5 Die Kinetik der siRNA-vermittel
Seite 37 und 38:
2.5 Die Kinetik der siRNA-vermittel
Seite 39 und 40:
2.6 Die Familie der dsRNA-bindenden
Seite 41 und 42:
2.6 Die Familie der dsRNA-bindenden
Seite 43:
2.7 Ziel dieser Arbeit der Freisetz
Seite 46 und 47:
3 Material Deutschland), Roche (Bas
Seite 48 und 49:
3 Material UV-Quarzküvetten (70 µ
Seite 50 und 51:
3 Material Stains-All Sigma-Aldrich
Seite 52 und 53:
3 Material Coomassie-Entfärbelösu
Seite 54 und 55:
3 Material Trenngelpuer (4×) 1,5 M
Seite 56 und 57:
3 Material pQE-T7-His-hAgo2 Eigensc
Seite 58 und 59:
3 Material 3.8.4 Primer Name Ago2 f
Seite 60 und 61:
3 Material Anti-Tetra-His (monoklon
Seite 62 und 63:
4 Methoden Mini-Präparation (klein
Seite 64 und 65:
4 Methoden Acrylamidkonzentration (
Seite 66 und 67:
4 Methoden 4.1.6 Restriktionshydrol
Seite 68 und 69:
4 Methoden 4.1.11 Kryokonservierung
Seite 70 und 71:
4 Methoden Die in vitro Transkripti
Seite 72 und 73:
4 Methoden 5'-Endmarkierung wurde u
Seite 74 und 75:
4 Methoden schwache Absorption aufw
Seite 76 und 77:
4 Methoden Komponente Sammelgel Tre
Seite 78 und 79:
4 Methoden Es wurde für 90 min ein
Seite 80 und 81:
4 Methoden Protein Temperatur der H
Seite 82 und 83:
4 Methoden Die Rückfaltung von hAg
Seite 84 und 85:
4 Methoden Reinigung von hTRBP-His
Seite 86 und 87:
4 Methoden Ansätzen zum Reaktionss
Seite 88 und 89:
4 Methoden Abbildung 4.1: Schematis
Seite 90 und 91:
4 Methoden Xenon‐Lampe Excitation
Seite 92 und 93:
4 Methoden gewertet; allerdings die
Seite 94 und 95:
4 Methoden verwendeten Lösungsmitt
Seite 96 und 97:
5 Ergebnisse NHA-hAgo2 nur in Anwes
Seite 98 und 99:
5 Ergebnisse NHA hAgo2 A kDa Gesamt
Seite 100 und 101:
5 Ergebnisse Konstrukte wurden mit
Seite 102 und 103:
5 Ergebnisse hTRBP H A kDa Gesamtze
Seite 104 und 105:
5 Ergebnisse NHA hAgo2 A DNaseI & T
Seite 106 und 107:
5 Ergebnisse konnte mit der bisher
Seite 108 und 109:
5 Ergebnisse Präzipitationskontrol
Seite 110 und 111:
5 Ergebnisse Studien zur Optimierun
Seite 112 und 113:
5 Ergebnisse zum Anderen den angest
Seite 114 und 115:
5 Ergebnisse 5.4.3 Entwicklung eine
Seite 116 und 117:
5 Ergebnisse die Experimente in ein
Seite 118 und 119:
5 Ergebnisse 5.5.3 Einuss der Tempe
Seite 120 und 121:
5 Ergebnisse In beiden Experimenten
Seite 122 und 123:
Mass (%) 5 Ergebnisse NHA hAgo2 90
Seite 124 und 125:
5 Ergebnisse NHA hAgo2 A 110 100 B
Seite 126 und 127:
5 Ergebnisse säuren und durch SYBR
Seite 128 und 129:
5 Ergebnisse Bereich bestimmen [204
Seite 130 und 131:
5 Ergebnisse der Gelverzögerungs-A
Seite 132 und 133:
5 Ergebnisse Oligomerisierungszusta
Seite 134 und 135:
Fluoreszenz cpm 5 Ergebnisse GST hA
Seite 136 und 137:
Fluoreszenz 5 Ergebnisse Bestimmung
Seite 138 und 139:
5 Ergebnisse mit unterschiedlichen
Seite 140 und 141:
elative Fluoreszenz relative Fluore
Seite 142 und 143:
elative Fluoreszenz k 1, obs (s -1
Seite 144 und 145:
5 Ergebnisse Entlassung des guide R
Seite 146 und 147:
5 Ergebnisse A B C FAM FAM P P‐as
Seite 148 und 149:
Fluoreszenz 5 Ergebnisse GST hAgo2
Seite 150 und 151:
5 Ergebnisse guide RNA target RNA k
Seite 152 und 153:
Fluoreszenz 5 Ergebnisse GST hAgo2
Seite 154 und 155: 5 Ergebnisse und ist somit konsiste
Seite 156 und 157: 5 Ergebnisse k = 0,0004 (± 0,00001
Seite 158 und 159: % Umsatz % Umsatz 1/ k k (s -1 ) 5
Seite 160 und 161: % Umsatz 5 Ergebnisse Einsatz der k
Seite 162 und 163: 5 Ergebnisse FAM P BHQ 2h 25°C FAM
Seite 164 und 165: Fluoreszenz 5 Ergebnisse Wie unter
Seite 166 und 167: Fluoreszenz Fluoreszenz 5 Ergebniss
Seite 168 und 169: elative Fluoreszenz k 1, obs (s -1
Seite 170 und 171: 5 Ergebnisse 5.11.3 Zusammenfassung
Seite 172 und 173: % Umsatz 5 Ergebnisse wird, stehen
Seite 175 und 176: 6 Diskussion Das Protein hAgo2 stel
Seite 177 und 178: 6.1 Untersuchung der siRNA-vermitte
Seite 179 und 180: 6.2 Stabilität von rekombinantem h
Seite 181 und 182: 6.3 Charakterisierung der siRNA-ver
Seite 199 und 200: 6.4 Charakterisierung der siRNA-Bin
Seite 201 und 202: 6.4 Charakterisierung der siRNA-Bin
Seite 203: 6.5 Modell der minimalen rekombinan
Seite 207 und 208: 7 Literaturverzeichnis [1] Paterson
Seite 209 und 210: 7 Literaturverzeichnis [23] Stefani
Seite 211 und 212: 7 Literaturverzeichnis [47] Czech,
Seite 213 und 214: 7 Literaturverzeichnis [70] Gregory
Seite 215 und 216: 7 Literaturverzeichnis [93] Lee, D.
Seite 217 und 218: 7 Literaturverzeichnis [115] Aravin
Seite 219 und 220: 7 Literaturverzeichnis [136] Ohrt,
Seite 221 und 222: 7 Literaturverzeichnis [160] Montgo
Seite 223 und 224: 7 Literaturverzeichnis [184] Schube
Seite 225 und 226: 7 Literaturverzeichnis [208] Tian,
Seite 227 und 228: 7 Literaturverzeichnis [227] Lee, K
Seite 229 und 230: 7 Literaturverzeichnis [250] Ehresm
Seite 231: 7 Literaturverzeichnis [272] van Ho
Seite 234 und 235: A Anhang Bindungspartner miteinande
Seite 236 und 237: A Anhang mit B = Basislinie der Aut
Seite 238 und 239: A Anhang Erk extrazellulär regulie
Seite 240 und 241: A Anhang NMR nuclear magnetic reson
Seite 242 und 243: A Anhang Å Ångström µF Mikrofar
Seite 244 und 245: A Anhang 5.34 Pre-steady state Asso
Seite 246 und 247: A Anhang 5.5 Übersicht über die b
Seite 248 und 249: A Anhang meinen Freunden für Vers
Seite 250 und 251: Andrea Deerberg Stipendien 09/2011
Seite 252 und 253: Publikationsliste Originalartikel 2
Alle anzeigen

Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

Erfolgreiche ePaper selbst erstellen

Template löschen?

Als Template speichern?