Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6 Diskussion
Abbildung 2.7). Zu diesen vier Teilprozessen wurden quantitative biochemische und kinetische
Analysen durchgeführt. Mittels Protein/RNA-Bindungsstudien wurden Substratbindungsparameter
wie die Anität von hAgo2 für siRNA bzw. die Anität des binären Komplexes zur
target RNA gemessen. Die Bindungsreaktionen wurden anschlieÿend in Bezug auf die Anzahl
der Phasen charakterisiert sowie die Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten
bestimmt. Die sequenzspezische target RNA-Spaltung durch hAgo2 wurde untersucht
und schlieÿlich die Freisetzung der Spaltprodukte charakterisiert. Mit Hilfe der experimentell
ermittelten Parameter wurde ein minimales kinetisches Modell der siRNA-abhängigen
hAgo2-vermittelten target RNA-Spaltung etabliert. Im Folgenden werden die Ergebnisse der
Untersuchungen zu den einzelnen Teilprozessen diskutiert.
6.3.1 Die Beladung von hAgo2 mit siRNA ist abhängig von der
Beschaenheit des 5'-Endes des guide Stranges
Als erster der vier oben beschriebenen Teilprozesse wurde die Beladung von hAgo2 mit drei
verschiedenen siRNA-Substraten untersucht. Während dieses Schrittes wird hAgo2 programmiert.
Da die Erkennung und Spaltung der target RNA in Abhängigkeit des guide Stranges
vollzogen wird, ist die initiale Beladung von hAgo2 von grundlegender Bedeutung für die
RNAi.
Die kleinen regulatorischen siRNAs und miRNAs teilen im zellulären Kontext drei Eigenschaften:
Sie sind etwa 19 25 nt lang. Auÿerdem tragen ihre 5'-Enden eine Phosphatgruppe
und ihre 3'-Enden weisen jeweils einen Überhang von 2 nt Länge auf [3033]. Bislang wurde angenommen,
dass rekombinantes hAgo2 in vitro im Gegensatz zum RISC innerhalb einer Zelle
oder bei Verwendung von Zellextrakt nur durch eine einzelsträngige guide RNA programmierbar
ist [35, 199]. Basierend auf diesen Eigenschaften wurden drei siRNA-Substrate gewählt,
um mechanistische Einsicht in die Beladung von rekombinantem hAgo2 zu erhalten. Alle drei
Substrate trugen aus experimentellen Gründen eine FAM-Markierung an Nukleotid 14 des
jeweiligen guide Stranges. Bei den siRNAs handelte es sich um den am 5'-Ende phosphorylierten
guide Strang P-as2B-FAM, den sequenzidentischen, unphosphorylierten guide Strang
OH-as2B-FAM sowie die doppelsträngige siRNA P-si2B-FAM, welche aus P-as2B-FAM und
dem komplementären Gegenstrang s2B besteht und derart hybridisiert ist, dass an den 3'-
Enden je zwei 2 nt lange Überhänge existieren (siehe Abschnitt 3.8.2 und Abbildung 5.22).
hAgo2 zeigt eine Präferenz für einzelsträngige, am 5'-Ende phosphorylierte RNA
Die Messung der Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten für einen Komplex aus GST-hAgo2
und P-as2B-FAM enthüllte eine hohe Anität des Proteins zu einem am 5'-Ende phosphorylierten
guide Strang (K d = 7,1 nM). In der Literatur sind bereits einige K d s für vergleichbare
Komplexe beschrieben [199, 260]. Der in dieser Arbeit ermittelte Wert ist mit diesen teilweise
gut vergleichbar (siehe Tabelle 6.1). Die Abweichungen könnten auf die Verwendung
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