Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6 Diskussion
vermutlich trotzdem mit guide RNA assoziieren kann. Da es sich bei diesen verkürzten Versionen
jedoch um C-terminal deletiertes Protein handelt (siehe Abschnitte 5.3.1 und 5.3.3) und
die eektive Beladung von hAgo2 die korrekte Faltung seines C-terminalen Bereiches erfordert,
besitzen diese deletierten Proteine vermutlich nur eingeschränkte bzw. gar keine enzymatische
Aktivität.
Die Geschwindigkeit der Phosphodiesterhydrolyse ist nicht bestimmbar
In Abschnitt 5.9.1 zeigte sich, dass die hohe zeitliche Auösung eines Standard-Spaltungsassays
den Hinweis auf die Existenz einer burst Phase zu Beginn der Reaktion lieferte. Allerdings
liegt der initiale Umsatz am Rande der Detektierbarkeit. Die entsprechende Geschwindigkeitsratenkonstante
k 1 repräsentiert vermutlich die single turnover Reaktion, während die zweite
Geschwindigkeitsratenkonstante k 2 einem multiplen Umsatz zuzuordnen ist, wie dies bereits
früher beobachtet wurde [6163]. Der beobachtete Reaktionsverlauf ist konsistent mit publizierten
Daten, jedoch ist die hier ermittelte Ratenkonstante der multiple turnover Reaktion
mit 0,0004 s -1 um den Faktor 4 langsamer als diejenige, die von Ameres et al. publiziert wurde
[200]. Dies kann mit der bereits erläuterten Tatsache zusammenhängen, dass ein Teil der
Komplexe keine enzymatische Aktivität aufweist.
Es konnte ein Experiment unter Verwendung kompetierender RNA etabliert werden, in
dem kein multipler Umsatz stattndet (siehe Abschnitt 5.9.4). Es zeigte sich allerdings, dass
auch dieses System nicht geeignet war, um eine verlässliche Geschwindigkeitsratenkonstante
zu ermitteln. Die Sensitivität des Experiments ist für die Gewinnung qualitativ hochwertiger
Daten nicht geeignet.
Es besteht die Annahme, dass die endonukleolytische Spaltung schneller abläuft als die Gesamtreaktion
und dadurch nicht limitierend ist. Dies ist nach einem strukturellen Vergleich
zwischen der PIWI Domäne von P. furiosus Ago und der humanen RNase H1 zu erwarten.
Beide weisen eine sehr ähnliche Faltung auf und enthalten eine Katalytische Triade, die in
vergleichbarer Weise angeordnet ist [26, 27, 62, 164]. Auÿerdem sind beide Enzyme von Mg 2+
abhängig und generieren sich ähnelnde Spaltprodukte [163, 166168]. Zusammengefasst impliziert
dies einen ähnlichen Katalyse-Mechanismus. Da die steady state Ratenkonstante der
RNA-Spaltung durch hRNase H1 0,05 s -1 beträgt (siehe Tabelle 2.2) [203], steht zu vermuten,
dass es sich bei der target RNA-Spaltung durch hAgo2 ähnlich verhält. Eine weitere Überlegung
macht die Annahme plausibel, dass der katalytische Schritt eine hohe Geschwindigkeitsratenkonstante
besitzt. Die Assemblierung ternärer Komplexe, die der Katalyse vorgeschaltet
ist, ist ein relativ langsamer Prozess (siehe Abschnitt 5.8.3). Da im zellulären Kontext beide
Reaktionen miteinander gekoppelt sind, würde die Entfernung spaltungskompetenter ternärer
Komplexe aus dem System durch die target RNA-Spaltung das Gleichgewicht der Bindungsreaktion
in Richtung der Assoziation verschieben. Je schneller also die Hydrolyse abläuft, desto
mehr wird die Bildung ternärer Komplexe erleichtert. Für eine denitive Aussage zur Ge-
186