Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...
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4.1 Molekularbiologische Methoden<br />
Gröÿenmarker (siehe Abschnitt 3.10) eingesetzt. Die Visualisierung <strong>der</strong> getrennten Nukleinsäuren<br />
erfolgte wie unter Abschnitt 4.1.4 beschrieben. Bei präparativen Ansätzen wurden die<br />
gewünschten Banden wie unter Abschnitt 4.1.5 beschrieben aus dem Gel isoliert.<br />
Polyacrylamid-Gelelektrophorese<br />
Kurzkettige Nukleinsäuren wurden durch eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) mit<br />
1 × TBE (siehe Abschnitt 3.6) als Laufpuer aufgetrennt. Die für die PAGE verwendeten<br />
Lösungen wurden zuvor durch eine Membran mit 0,2 µm Porengröÿe ltriert und entwe<strong>der</strong><br />
im Ultraschallbad o<strong>der</strong> durch Anlegen eines Vakuums für etwa 15 min entgast. Zum Nachweis<br />
<strong>der</strong> Bandengröÿe wurde ein adäquater Gröÿenmarker (siehe Abschnitt 3.10) eingesetzt. Die<br />
Visualisierung <strong>der</strong> getrennten Nukleinsäuren erfolgte wie unter Abschnitt 4.1.4 beschrieben.<br />
Zur Analyse doppelsträngiger Nukleinsäuren wurde die PAGE unter nicht-denaturierenden<br />
Bedingungen durchgeführt (nPAGE). Je nach Länge <strong>der</strong> Nukleinsäuren wurde die Prozentigkeit<br />
<strong>der</strong> Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (Vernetzungsgrad 19:1, v/v) mit 1 × TBE eingestellt<br />
(siehe Tabelle 4.3).<br />
Acrylamidkonzentration (%, v/v)<br />
Nukleinsäurelänge (bp)<br />
3,5 100 2.000<br />
5,0 75 500<br />
8,0 50 400<br />
12,0 35 250<br />
15,0 20 150<br />
20,0 5 100<br />
Tabelle 4.3: Acrylamidkonzentrationen für die nicht-denaturierende PAGE in Abhängigkeit <strong>der</strong> Nukleinsäurelänge.<br />
Zur Polymerisation wurden <strong>der</strong> Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung 0,1 % (w/v) APS sowie<br />
0,1 % (v/v) TEMED zugesetzt. Die Proben wurden mit Ladepuer für nicht-denaturierende<br />
PAA-Gele (siehe Abschnitt 3.6) eingestellt. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in<br />
einer vertikalen Gelkammer bei 0,7 mA/cm Gellänge für 1 4 h bei 4 ◦ C, um eine Denaturierung<br />
<strong>der</strong> Nukleinsäuren durch zu hohe Temperaturen zu verhin<strong>der</strong>n.<br />
Zur Analyse einzelsträngiger Nukleinsäuren wurde die PAGE unter denaturierenden Bedingungen<br />
in Anwesenheit von 7 M Harnsto durchgeführt (dPAGE). Je nach Länge <strong>der</strong> Nukleinsäuren<br />
wurde die Prozentigkeit <strong>der</strong> Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (Vernetzungsgrad<br />
19:1, v/v) mit 1 × TBE eingestellt (siehe Tabelle 4.4).<br />
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