Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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Acrylamidkonzentration (%, v/v)
Nukleinsäurelänge (nt)
4,0 100 500
5,0 70 300
6,0 45 70
8,0 35 45
10,0 25 35
20,0 8 25
Tabelle 4.4: Acrylamidkonzentrationen für die denaturierende PAGE in Abhängigkeit der Nukleinsäurelänge.
Zur Polymerisation wurden der Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung inklusive 7 M Harnsto
0,1 % (w/v) APS sowie 0,1 % (v/v) TEMED zugesetzt. Die Proben wurden mit Ladepuer für
denaturierende PAA-Gele (siehe Abschnitt 3.6) eingestellt und vor dem Auftrag auf das Gel
für 3 min bei 95 ◦ C denaturiert. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in einer vertikalen
Gelkammer bei 0,7 mA/cm Gellänge für 30 90 min. Um denaturierende Bedingungen zu
gewährleisten, wurde das Gel durch eine Vorelektrophorese auf ca. 50 ◦ C erwärmt und diese
Temperatur während der Elektrophorese konstant gehalten.
Für die nukleotidgenaue Auftrennung einzelsträngiger Nukleinsäuren wurde als Sonderform
der dPAGE ein Sequenziergelsystem verwendet. Die Sequenziergele wurden in einer
Gröÿe von 0,4 mm × 20 cm × 40 cm hergestellt. Zur besseren Ablösung des Gels wurden die
Glasplatten zuvor mit einer Silikonlösung (Sigmacote R○ , siehe Abschnitt 3.3) beschichtet. Die
in Ladepuer für denaturierende PAA-Gele aufgenommenen Proben wurden für 3 min bei
95 ◦ C denaturiert und nach gründlichem Spülen der Geltaschen geladen. Die Elektrophorese
erfolgte bei konstanten 52 ◦ C und 70 W für 1 2 h.
4.1.4 Detektion von Nukleinsäuren in Elektrophoresegelen
Ethidiumbromid-Färbung
Die Visualisierung von Nukleinsäuren in Agarosegelen erfolgte mit Hilfe des interkalierenden
Fluoreszenzfarbstos Ethidiumbromid. Dafür wurde dem jeweiligen Ladepuer 0,00025 %
(w/v) Ethidiumbromid zugesetzt. Weiterhin enthielt die Gellösung 0,0004 % (w/v) Ethidiumbromid.
Nach der Elektrophorese wurde das Agarosegel mit UV-Licht der Wellenlänge 312 nm
bestrahlt und zu Dokumentationszwecken fotograert. Die Nachweisgrenze für DNA und RNA
liegt bei ca. 5 ng pro Bande.
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