Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.2 Methoden im Umgang mit Nukleinsäuren
tration wurde wie unter Abschnitt 4.2.1 beschrieben bestimmt.
Isopropanolpräzipitation
Zur Fällung von Plasmid-DNA nach einer Maxi-Präparation (siehe Abschnitt 4.1.2) wurde
eine Präzipitation mit Hilfe von Isopropanol eingesetzt. Dafür wurde die Nukleinsäure-Lösung
mit dem 0,7 1 × Volumen Isopropanol versetzt und für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Die präzipitierte Nukleinsäure wurde durch Zentrifugation für 45 min bei 12.000 × g und 4 ◦ C
sedimentiert, 2 × mit 70 % (v/v) eiskaltem Ethanol gewaschen, bei Raumtemperatur getrocknet
und in einem beliebigen Volumen H 2 O aufgenommen. Die Konzentration wurde wie unter
Abschnitt 4.2.1 beschrieben bestimmt.
4.2.6 Modikation von Nukleinsäure-5'-Enden
Dephosphorylierung von 5'-Enden
Die Dephosphorylierung erfolgte durch die Hydrolyse von 5'-Phosphatgruppen mittels Alkalischer
Phosphatase (AP) und wurde als Vorbereitung für eine eektive radioaktive 5'-
Endmarkierung von target RNA eingesetzt.
20 pmol in vitro Transkript (siehe Abschnitt 4.2.3) wurden unter RNase-freien Bedingungen
in 1 × Dephosphorylierungspuer mit 0,4 u/µl RiboLock RNase Inhibitor und 0,1 u/µl AP
für 2 h bei 50 ◦ C inkubiert. Anschlieÿend erfolgte eine Phenol/Chloroform-Extraktion (siehe
Abschnitt 4.2.4) und eine Ethanolpräzipitation (siehe Abschnitt 4.2.5). Die Integrität des in
vitro Transkriptes wurde durch Agarose-Gelelektrophorese (siehe Abschnitt 4.1.3) überprüft.
Bis zu seiner weiteren Verwendung wurde das dephosphorylierte in vitro Transkript bei 20 ◦ C
gelagert.
Phosphorylierung von 5'-Enden
Die Phosphorylierung erfolgte mit Hilfe des Enzyms T4 Polynukleotidkinase (T4 PNK), die
den Transfer einer ATP-Phosphatgruppe auf das hydroxylierte 5'-Ende eines Nukleinsäurestranges
katalysiert.
500 pmol Nukleinsäure wurden in 1 × PNK-Puer A mit 1 mM ATP und 1 u/µl T4 PNK
für 1 h bei 37 ◦ C und anschlieÿend für 10 min bei 75 ◦ C inkubiert. Das nicht inkorporierte ATP
wurde durch Gelltration mit einer Sephadex-G-50 Säule nach Herstellerangaben abgetrennt.
Anschlieÿend erfolgte eine Phenol/Chloroform-Extraktion (siehe Abschnitt 4.2.4) und eine
Ethanolpräzipitation (siehe Abschnitt 4.2.5).
Radioaktive 5'-Endmarkierung von Nukleinsäuren
Für die spätere Detektion mittels Autoradiographie (siehe Abschnitt 4.1.4) wurde target RNA
analog zur 5'-Phosphorylierung von Nukleinsäuren mit [γ- 32 P]-ATP radioaktiv markiert. Die
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