Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.3 Expression von rekombinantem hAgo2 und hTRBP
GST
hAgo2
A
kDa
130
95
72
55
43
34
Gesamtzelllysat
0 1 2
lösliche
Fraktion
unlösliche
Fraktion
0 1 2 0 1 2
h n.I.
B
kDa
130
95
72
55
43
34
-hAgo2
-GST
C
kDa
130
95
72
55
43
34
Gesamtzelllysat
0 1 2
lösliche
Fraktion
0 1 2
GST
unlösliche
Fraktion
0 1 2
hAgo2
h n.I.
D
kDa
130
95
72
55
43
34
H
-hAgo2
-GST
-His
Abbildung 5.4: Expression von GST-hAgo2-Fusionsproteinen unter optimierten Bedingungen (siehe
Abschnitt 4.3.6). Die Anzucht der Stämme BL21(DE3)-pET41b(+)-GST-hAgo2-His bzw. BL21(DE3)-
pET41b(+)-GST-hAgo2 erfolgte in TFB-Medium bei 37 ◦ C für 2 h. E. coli Zellextrakte wurden auf
Anwesenheit der Zielproteine sowie ihre Verteilung auf die lösliche und unlösliche Fraktion untersucht.
(A, C) Detektion von GST-hAgo2 bzw. GST-hAgo2-His durch Coomassie-Färbung. (B, D) Western-
Analyse von GST-hAgo2 bzw. GST-hAgo2-His mittels α-hAgo2-, α-GST- sowie α-His-Antikörper. Die
Banden vollständig translatierter Zielproteine sind mit einem Pfeil gekennzeichnet. h n.I.: Stunden
nach Induktion.
5.3.4 Studien zur Optimierung der Expression von hTRBP-His
In dieser Arbeit sollte neben hAgo2 ein weiteres Protein charakterisiert werden, um Erkenntnisse
über seine Rolle bei der RNA-Interferenz zu gewinnen: hTRBP. Es ist als Interaktionspartner
von hAgo2 identiziert und spielt vermutlich eine Rolle bei der Beladung des RISC (siehe
Abschnitt 2.6.1). Der hierzu benötigte Expressionsstamm BL21(DE3)-pET41b(+)-hTRBP-
His wurde freundlicherweise von Dr. R. Kretschmer-Kazemi Far zur Verfügung gestellt. Weiterhin
lag ein Protokoll zur Expression und Reinigung unter denaturierenden Bedingungen,
gefolgt von der Rückfaltung des Proteins, aus Vorarbeiten der AG Kretschmer-Kazemi Far
vor. Um die Unsicherheit der Rückfaltungsezienz zu umgehen, wurden Anstrengungen un-
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