Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.6 Ausblick
einer konformationellen Umlagerung des ternären Komplexes, der vermutlich die Freisetzung
des 3'-Endes der guide RNA zur Folge hat. Daraufhin können sich über den seed Bereich hinaus
weitere Basen zwischen guide und target RNA paaren und es wird ein katalytisch kompetenter
Komplex generiert.
Katalyse Die endonukleolytische Spaltung erfolgt in Abhängigkeit der guide RNA-Sequenz
am Phosphatrückgrat der target RNA gegenüber dem 10. und 11. Nukleotid des guide Stranges.
Die Spaltung erfolgt nach Programmierung von hAgo2 mit einer einzelsträngigen oder
doppelsträngigen siRNA.
Regeneration Für einen multiplen Umsatz muss nach erfolgter Spaltung der target RNA
der binäre Komplex regeneriert werden. Dies erfordert die Freisetzung der Spaltprodukte, was
aller Wahrscheinlichkeit nach den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Gesamtreaktion
darstellt.
6.6 Ausblick
In dieser Arbeit ist es gelungen, ein kinetisches Modell der siRNA-vermittelten target RNA-
Spaltung zu etablieren und die einzelnen beobachteten Schritte entsprechend zuzuordnen. Dennoch
bleiben weiterhin viele Details dieses Prozesses ungenügend verstanden bzw. während der
Arbeit an diesem Projekt sind weitere Fragen aufgetreten, die im Rahmen dieser Dissertation
nicht beantwortet werden konnten. Im Folgenden werden einige davon aufgeführt.
Das etablierte Expressions- und Reinigungssystem für GST-hAgo2 liefert im Milligramm-
Maÿstab Protein mit sehr hoher Aktivität, was für in vitro Studien eine zwingende Voraussetzung
darstellt. Der Reinheitsgrad konnte gegenüber dem zuvor verwendeten NHA-hAgo2
ebenfalls verbessert sowie die Stabilität erhöht werden. Allerdings stellen diese beiden Faktoren
Reinheit und Stabilität nach wie vor die beiden gröÿten Hürden für die Handhabung
des Proteins und somit auch für zukünftige Studien dar. Für eine eindeutige Zuordnung kinetischer
Parameter zu konformationellen Umlagerungen ist es nötig, die Röntgenkristallstruktur
von humanem Ago2 im Komplex mit verschiedenen Substraten zu lösen. Dieses Ziel ist bislang
nicht erreicht. Wenn dies gelingen soll, muss das vorhandene Reinigungssystem weiter
optimiert werden.
Während der Arbeit zeigte sich, dass entgegen der bisher geltenden Meinung rekombinantes
hAgo2 durch doppelsträngige siRNA programmierbar ist. Wie dieser Prozess genau
vonstatten geht, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Weitere Experimente
werden nötig sein, um den Mechanismus genauer zu untersuchen und die siRNA-
Strangtrennungseigenschaften von hAgo2 besser zu verstehen. Es konnten ebenfalls erste Hinweise
darauf gewonnen werden, dass hTRBP möglicherweise die Beladung von hAgo2 Dicerunabhängig
erleichtert, wohingegen hPACT diese Eigenschaft nicht aufzuweisen scheint. Die
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