Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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4 Methoden verwendeten Lösungsmittels wurde mit einem Refraktometer bestimmt. Da Verunreinigungen oder Luftblasen zu massiven Fehlern in der Messung führen, wurden die Proben sorgfältig vorbereitet. Zur Abtrennung groÿer Aggregate wurden die Proteinlösungen vor dem Einfüllen in die Küvette für 10 min bei 3.000 × g und 4 ◦ C in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, anschlieÿend der Überstand mit staubfreien Pipettenspitzen überführt und die Küvette zum Entfernen von Luftblasen für 5 min bei 2.800 rpm in einer speziell für Küvetten vorgesehenen Zentrifuge zentrifugiert. 84
5 Ergebnisse 5.1 Vorarbeiten zu diesem Dissertationsprojekt Grundlage für die im Rahmen dieser Dissertation geplanten Studien war ein bakterielles Expressionskonstrukt für rekombinantes NHA-hAgo2 (pET24(+)-NHA-hAgo2 im E. coli Stamm BL21(DE3)) sowie ein Protokoll zur Isolierung des Proteins aus inclusion bodies (Einschlusskörperchen) unter denaturierenden Bedingungen und seine anschlieÿende Rückfaltung. Beides wurde freundlicherweise von C. Geist (Institut für Molekulare Medizin, Universität zu Lübeck) zur Verfügung gestellt. Nach Durchführung von Expression, Isolierung und Rückfaltung lag partiell gereinigtes, in vitro enzymatisch aktives Protein im Milligramm-Maÿstab vor. Allerdings war der Reinheitsgrad des gewonnenen NHA-hAgo2 für die geplanten Studien nicht ausreichend hoch, da die Präparation eine groÿe Anzahl kürzerer Proteinfragmente aufwies, die sehr wahrscheinlich auf translationale Abbrüche während der Expression zurückzuführen sind (siehe Abschnitte 5.3.1 und 5.3.3). Somit wurden verschiedene Strategien zur Gewinnung einer ausreichend homogenen, enzymatisch aktiven und mengenmäÿig zufriedenstellenden Proteinpräparation verfolgt. Trotz aufwändiger Bemühungen ist bislang in der wissenschaftlichen Literatur die Expression und Aufreinigung von bakteriell exprimiertem, rekombinantem hAgo2, das derartigen Ansprüchen gerecht wird, nicht beschrieben. 5.2 Strategien zur Gewinnung von rekombinantem hAgo2 für biochemische Studien Für die Entwicklung neuer Strategien zur Gewinnung von rekombinantem hAgo2 mussten zwei wesentliche Faktoren berücksichtigt werden: die schlechte Löslichkeit des Proteins während der Expression sowie die unvollständige Translation, die neben dem vollständig translatierten Protein jeweils eine Vielzahl weiterer, kürzerer Produkte hervorbrachte. Im ersten Fall war zwar ein Protokoll zur Isolierung von NHA-hAgo2 unter denaturierenden Bedingungen mit anschlieÿender Rückfaltung etabliert, jedoch stellte dies keine ideale Voraussetzung für die im Rahmen des Dissertationsprojektes geplanten Studien dar. Zum Einen gibt es keine Möglichkeit festzustellen, wie ezient die Rückfaltung des mit 103,8 kDa relativ groÿen Proteins und somit wie groÿ der Anteil an inaktivem Enzym ist. Zum Anderen konnte 85
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Aus dem Institut für Molekulare Me
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Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassun
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4.3.3 Gelelektrophorese zur Analyse
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5.12 Untersuchung des Einusses von
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1 Zusammenfassung Die RNA-Interfere
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Summary RNA interference (RNAi) is
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2 Einleitung 2.1 Über die Bedeutun
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2.2 Genregulation durch RNA-Interfe
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2.2 Genregulation durch RNA-Interfe
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2.3 Die Familie der Argonaute Prote
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2.4 Die strukturellen und molekular
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2.5 Die Kinetik der siRNA-vermittel
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2.6 Die Familie der dsRNA-bindenden
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2.6 Die Familie der dsRNA-bindenden
Seite 43: 2.7 Ziel dieser Arbeit der Freisetz
Seite 46 und 47: 3 Material Deutschland), Roche (Bas
Seite 48 und 49: 3 Material UV-Quarzküvetten (70 µ
Seite 50 und 51: 3 Material Stains-All Sigma-Aldrich
Seite 52 und 53: 3 Material Coomassie-Entfärbelösu
Seite 54 und 55: 3 Material Trenngelpuer (4×) 1,5 M
Seite 56 und 57: 3 Material pQE-T7-His-hAgo2 Eigensc
Seite 58 und 59: 3 Material 3.8.4 Primer Name Ago2 f
Seite 60 und 61: 3 Material Anti-Tetra-His (monoklon
Seite 62 und 63: 4 Methoden Mini-Präparation (klein
Seite 64 und 65: 4 Methoden Acrylamidkonzentration (
Seite 66 und 67: 4 Methoden 4.1.6 Restriktionshydrol
Seite 68 und 69: 4 Methoden 4.1.11 Kryokonservierung
Seite 70 und 71: 4 Methoden Die in vitro Transkripti
Seite 72 und 73: 4 Methoden 5'-Endmarkierung wurde u
Seite 74 und 75: 4 Methoden schwache Absorption aufw
Seite 76 und 77: 4 Methoden Komponente Sammelgel Tre
Seite 78 und 79: 4 Methoden Es wurde für 90 min ein
Seite 80 und 81: 4 Methoden Protein Temperatur der H
Seite 82 und 83: 4 Methoden Die Rückfaltung von hAg
Seite 84 und 85: 4 Methoden Reinigung von hTRBP-His
Seite 86 und 87: 4 Methoden Ansätzen zum Reaktionss
Seite 88 und 89: 4 Methoden Abbildung 4.1: Schematis
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Seite 96 und 97: 5 Ergebnisse NHA-hAgo2 nur in Anwes
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Seite 100 und 101: 5 Ergebnisse Konstrukte wurden mit
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Seite 106 und 107: 5 Ergebnisse konnte mit der bisher
Seite 108 und 109: 5 Ergebnisse Präzipitationskontrol
Seite 110 und 111: 5 Ergebnisse Studien zur Optimierun
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Seite 116 und 117: 5 Ergebnisse die Experimente in ein
Seite 118 und 119: 5 Ergebnisse 5.5.3 Einuss der Tempe
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Fluoreszenz 5 Ergebnisse GST hAgo2
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5 Ergebnisse und ist somit konsiste
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% Umsatz % Umsatz 1/ k k (s -1 ) 5
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% Umsatz 5 Ergebnisse Einsatz der k
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% Umsatz 5 Ergebnisse wird, stehen
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6 Diskussion Das Protein hAgo2 stel
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6.5 Modell der minimalen rekombinan
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6.6 Ausblick einer konformationelle
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7 Literaturverzeichnis [1] Paterson
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7 Literaturverzeichnis [23] Stefani
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7 Literaturverzeichnis [227] Lee, K
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7 Literaturverzeichnis [250] Ehresm
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7 Literaturverzeichnis [272] van Ho
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A Anhang Bindungspartner miteinande
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A Anhang mit B = Basislinie der Aut
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A Anhang meinen Freunden für Vers
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