Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.1 Untersuchung der siRNA-vermittelten RNAi mit Hilfe von rekombinanten Komponenten
pression, Reinigung und Handhabung beobachtet werden. Dennoch gelang die Isolierung von
rekombinantem hAgo2 nach Expression in E. coli Zellen mit sehr hoher Ausbeute und groÿer
enzymatischer Aktivität. Diese ist eine wichtige Voraussetzung für Studien, bei denen geringe
Unterschiede beobachtet werden. Beispielsweise war es bislang nicht möglich, rekombinantes
hAgo2 mit einer doppelsträngigen siRNA zu programmieren und im Anschluss die Spaltung einer
target RNA zu beobachten [35, 199]. In der Studie von Liu et al. konnte bei vergleichenden
Analysen der target RNA-Spaltung nach Programmierung mit einzel- bzw. doppelsträngiger
siRNA im Falle einer guide RNA ein Umsatz von schätzungsweise unter 10 % erzielt werden.
Deshalb steht zu vermuten, dass nach Programmierung mit einem Doppelstrang der Umsatz
für eine Detektion zu gering war [35]. Das in dieser Arbeit gewonnene GST-hAgo2 weist einen
maximalen Umsatz von über 90 % auf (siehe Abbildung 5.12 C und D) und stellt damit nach
bisherigem Kenntnisstand das bislang aktivste rekombinante hAgo2 dar.
Während dieser Arbeit konnten Erkenntnisse zur Handhabung von hAgo2 gewonnen werden,
die für die Interpretation der damit generierten Daten wichtig sind. Es zeigte sich, dass
hAgo2 nur eingeschränkt lagerfähig ist. Zum Einen mussten häuge Frier-Tau-Zyklen vermieden
werden, zum Anderen nahm die Aktivität von GST-hAgo2 und NHA-hAgo2 während
der Lagerung bei 20 ◦ C über mehrere Monate kontinuierlich ab, bis schlieÿlich nur noch ein
maximaler target RNA-Umsatz von ca. 30 % beobachtet werden konnte. Deshalb wurden vergleichende
Analysen unter den einzelnen Proteinpräparationen stets kurz nach ihrer Isolierung
durchgeführt (siehe Abschnitt 5.5.2). Die Untersuchung des Einusses unterschiedlicher Faktoren
fanden entweder im selben Experiment oder stets mit frischen Aliquots hAgo2 statt.
Trotz der beschriebenen Einschränkungen sind somit Studien über einen langen Zeitraum
möglich. Dies ist nicht der Fall für bakteriell exprimiertes murines Ago2 (mAgo2), das von der
Arbeitsgruppe um Salvatore innerhalb von 24 36 h verwendet werden musste [257].
Unabhängig von den Erfolgen bei der Weiterentwicklung vorhandener Expressions- und
Reinigungssysteme für rekombinantes hAgo2 bestehen auch für das hier verwendete hAgo2
nach wie vor zwei Hauptprobleme. Es liegen neben vollständig translatiertem Protein eine
Vielzahl kürzerer Versionen vor, wie dies bereits früher beschrieben wurde [255]. Diese konnten
durch die gewählte Reinigungsstrategie nicht entfernt werden. Allerdings stellt im Fall von
GST-hAgo2 das vollständig translatierte Protein das Hauptprodukt dar (siehe Abbildung
5.10 B). Durch Western-Analysen konnte gezeigt werden, dass es sich bei den Proteinbanden
mit höherer elektrophoretischer Mobilität um kürzere hAgo2-Versionen handelt, die am C-
Terminus deletiert sind (siehe Abbildung 5.4 B und D). Die verwendeten Proteinpräparationen
besitzen im Vergleich zu anderen Studien einen ähnlichen Reinheitsgrad [62, 238, 255, 257].
Das zweite Problem besteht in der Löslichkeit von hAgo2. Bereits bei der Reinigung von
GST-hAgo2 lag ein Teil des Proteins in partiell aggregierter Form vor. Im Gegensatz zu NHAhAgo2
sind allerdings keine störenden chemischen Substanzen für die Stabilisierung nötig. Bei
NHA-hAgo2 ergab sich das Problem, dass der Einsatz in einem Experiment die Verdünnung
167