Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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A Anhang mit B = Basislinie der Autokorrelationsfunktion bei unendlicher Verzögerungszeit, β = Amplitude bei τ = 0 und Γ = Abklingrate. Die gemessene Autokorrelationsfunktion wird nach der least square Methode an Gleichung A.12 angepasst und so die Abklingrate erhalten, mit deren Hilfe der Diusionskoezient D berechnet werden kann: D = Γ (A.13) q 2 Für den Streuvektor q gilt: q = 4πn ( ) θ λ sin 2 (A.14) mit n = Phasenfaktor, λ = Wellenlänge und θ = Streuwinkel. Für die Berechnung des hydrodynamischen Radius R h werden folgende Annahmen getroen: 1. Die Partikel in der Lösung bewegen sich mit Brown'scher Molekularbewegung. 2. Die Partikel sind spherisch. Für die Berechnung von R h gilt die Stokes-Einstein-Beziehung: R h = kT 6πηD (A.15) mit k = Boltzmann-Konstante, T = Temperatur in Kelvin und η = Viskosität des Lösungsmittels [273]. Aus dem hydrodynamischen Radius kann zuletzt das Molekulargewicht MW der untersuchten Partikel berechnet werden: MW (kDa) = (R h · R h − F aktor) 2,3398 (A.16) mit R h − F aktor = 1,68. A.2 Abkürzungsverzeichnis Im Folgenden sind die in dieser Arbeit verwendeten Abkürzungen erläutert. Bei englischsprachigen Abkürzungen ist die Erläuterung ebenfalls in englischer Sprache angegeben und soweit diese im deutschen Sprachgebrauch vorhanden ist, durch eine deutsche Übersetzung ergänzt. 3'-UTR A 260 A 280 3'-untranslatierte Region Absorption bei 260 nm Absorption bei 280 nm A. aeolicus Aquifex aeolicus A. fulgidus Archaeglobus fulgidus 226
A.2 Abkürzungsverzeichnis AG Arbeitsgruppe Ago Argonaute Ago2 Argonaute2 AIDS acquired immunodeciency syndrome, erworbenes Immundefektsyndrom AP Alkalische Phosphatase APS Ammoniumperoxodisulfat A. thaliana Arabidopsis thaliana ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaar BPB Bromphenolblau BSA bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise c Konzentration ca. circa CAPS 3-Cyclohexylamino-1-propansulfonsäure C. elegans Caenorhabditis elegans Ci Curie cm Zentimeter cm 2 Quadratzentimeter D Asparaginsäure ddNTP Didesoxynukleotidtriphosphat DGCR8 DiGeorge syndrome critical region gene 8 DLS Dynamische Lichtstreuung D. melanogaster Drosophila melanogaster DMSO Dimethylsulfoxid DNA desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleotidtriphosphat dPAGE denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese D. rerio Danio rerio ds double-stranded, doppelsträngig dsRBM dsRNA-bindendes Motiv dsRBP dsRNA-bindendes Protein DTT Dithiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat EIF2C2 eukaryotischer Translationsinitiationsfaktor 2C2 eIF4E eukaryotischer Translationsinitiationsfaktor 4E EMSA electrophoretic mobility shift assay, Gelverzögerungs-Analyse 227
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Aus dem Institut für Molekulare Me
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Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassun
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4.3.3 Gelelektrophorese zur Analyse
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5.12 Untersuchung des Einusses von
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1 Zusammenfassung Die RNA-Interfere
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Summary RNA interference (RNAi) is
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2 Einleitung 2.1 Über die Bedeutun
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2.2 Genregulation durch RNA-Interfe
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2.2 Genregulation durch RNA-Interfe
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2.3 Die Familie der Argonaute Prote
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2.4 Die strukturellen und molekular
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2.5 Die Kinetik der siRNA-vermittel
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2.5 Die Kinetik der siRNA-vermittel
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2.6 Die Familie der dsRNA-bindenden
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2.6 Die Familie der dsRNA-bindenden
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2.7 Ziel dieser Arbeit der Freisetz
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3 Material Deutschland), Roche (Bas
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3 Material UV-Quarzküvetten (70 µ
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3 Material Stains-All Sigma-Aldrich
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3 Material Coomassie-Entfärbelösu
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3 Material Trenngelpuer (4×) 1,5 M
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3 Material pQE-T7-His-hAgo2 Eigensc
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3 Material 3.8.4 Primer Name Ago2 f
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3 Material Anti-Tetra-His (monoklon
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4 Methoden Mini-Präparation (klein
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4 Methoden Acrylamidkonzentration (
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4 Methoden 4.1.6 Restriktionshydrol
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4 Methoden 4.1.11 Kryokonservierung
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4 Methoden Die in vitro Transkripti
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4 Methoden 5'-Endmarkierung wurde u
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4 Methoden schwache Absorption aufw
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4 Methoden Komponente Sammelgel Tre
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4 Methoden Es wurde für 90 min ein
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4 Methoden Protein Temperatur der H
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4 Methoden Die Rückfaltung von hAg
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4 Methoden Reinigung von hTRBP-His
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4 Methoden Ansätzen zum Reaktionss
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4 Methoden Abbildung 4.1: Schematis
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4 Methoden Xenon‐Lampe Excitation
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4 Methoden gewertet; allerdings die
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4 Methoden verwendeten Lösungsmitt
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5 Ergebnisse NHA-hAgo2 nur in Anwes
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5 Ergebnisse NHA hAgo2 A kDa Gesamt
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5 Ergebnisse Konstrukte wurden mit
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5 Ergebnisse hTRBP H A kDa Gesamtze
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5 Ergebnisse NHA hAgo2 A DNaseI & T
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5 Ergebnisse konnte mit der bisher
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5 Ergebnisse Präzipitationskontrol
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5 Ergebnisse Studien zur Optimierun
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5 Ergebnisse zum Anderen den angest
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5 Ergebnisse 5.4.3 Entwicklung eine
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5 Ergebnisse die Experimente in ein
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5 Ergebnisse 5.5.3 Einuss der Tempe
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5 Ergebnisse In beiden Experimenten
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Mass (%) 5 Ergebnisse NHA hAgo2 90
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5 Ergebnisse NHA hAgo2 A 110 100 B
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5 Ergebnisse säuren und durch SYBR
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5 Ergebnisse Bereich bestimmen [204
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5 Ergebnisse der Gelverzögerungs-A
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5 Ergebnisse Oligomerisierungszusta
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Fluoreszenz cpm 5 Ergebnisse GST hA
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Fluoreszenz 5 Ergebnisse Bestimmung
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5 Ergebnisse mit unterschiedlichen
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elative Fluoreszenz relative Fluore
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elative Fluoreszenz k 1, obs (s -1
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5 Ergebnisse Entlassung des guide R
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5 Ergebnisse A B C FAM FAM P P‐as
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Fluoreszenz 5 Ergebnisse GST hAgo2
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5 Ergebnisse guide RNA target RNA k
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Fluoreszenz 5 Ergebnisse GST hAgo2
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5 Ergebnisse und ist somit konsiste
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5 Ergebnisse k = 0,0004 (± 0,00001
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% Umsatz % Umsatz 1/ k k (s -1 ) 5
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% Umsatz 5 Ergebnisse Einsatz der k
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5 Ergebnisse FAM P BHQ 2h 25°C FAM
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Fluoreszenz 5 Ergebnisse Wie unter
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Fluoreszenz Fluoreszenz 5 Ergebniss
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elative Fluoreszenz k 1, obs (s -1
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5 Ergebnisse 5.11.3 Zusammenfassung
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% Umsatz 5 Ergebnisse wird, stehen
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6 Diskussion Das Protein hAgo2 stel
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6.1 Untersuchung der siRNA-vermitte
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6.2 Stabilität von rekombinantem h
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6.3 Charakterisierung der siRNA-ver
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6.3 Charakterisierung der siRNA-ver
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Seite 199 und 200: 6.4 Charakterisierung der siRNA-Bin
Seite 201 und 202: 6.4 Charakterisierung der siRNA-Bin
Seite 203 und 204: 6.5 Modell der minimalen rekombinan
Seite 205 und 206: 6.6 Ausblick einer konformationelle
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