Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

Fluoreszenz
5 Ergebnisse
Wie unter Abschnitt 5.10.1 dargestellt, ist davon auszugehen, dass im experimentellen Ansatz
ternäre Komplexe vorhanden sind, die gespaltene oder ungespaltene target RNA enthalten.
Wenn beide mit unterschiedlicher Geschwindigkeit freigesetzt würden, müsste dies
durch eine entsprechende Auswertung der experimentellen Daten durch eine zweifach exponentielle
Gleichung zwei verschiedene Ratenkonstanten ergeben. Allerdings wird die Dissoziationskinetik
in Abbildung 5.43 am besten durch eine einfach exponentielle Gleichung beschrieben.
Folglich kommt es zur Freisetzung von gespaltener und ungespaltener target RNA
mit der gleichen Geschwindigkeit (k = 0,0003 (± 0,000008) s -1 ). Die Ratenkonstante gleicht k -3
bei der Dissoziation ternärer Komplexe (k -3, ternär = 0,0003 s -1 ), was diese Annahme erhärtet.
Bemerkenswerterweise entspricht sie auÿerdem fast exakt derjenigen der Gesamtreaktion
(k gesamt = 0,0004 (± 0,00002) s -1 ). Damit kann die Annahme bestätigt werden, dass es sich bei
der Freisetzung der Spaltprodukte nach erfolgter Phosphodiesterhydrolyse um den geschwindigkeitsbestimmenden
Schritt der Gesamtreaktion handelt.
Um die Stabilität der ternären Komplexe näher zu untersuchen, wurden sie einer schrittweisen
Temperaturerhöhung unterzogen, um die Hybride aus P-as2B-FAM und s2B-BHQ
bzw. dem BHQ-tragenden 5'-Spaltprodukt zu schmelzen. In beiden Fällen sollte ein Anstieg
des Fluoreszenzsignals zu verzeichnen sein. Die berechneten Schmelztemperaturen betragen
T melt, 19mer = 53,2 ◦ C bzw. T melt, 9mer = 30,0 ◦ C.
Es wurden 600 nM GST-hAgo2 mit 20 nM P-as2B-FAM für 10 min bei 25 ◦ C in 1 × Ago-
Spaltungspuffer präinkubiert, die Assoziation durch die Fluoreszenzabnahme kontrolliert und
GST
hAgo2
1600
1400
1200
1000
800
0 2000 4000 6000 8000 10000
Zeit (s)
Abbildung 5.43: Kinetik der Freisetzung von 5'-Spaltprodukten nach guide RNA-vermittelter target
RNA-Spaltung durch GST-hAgo2. Durchführung siehe Text. Die experimentellen Daten wurden
mit Hilfe einer einfach exponentiellen Gleichung ausgewertet. Als Ratenkonstante ergab sich
k = 0,0003 (± 0,000008) s -1 .
154