Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.3 Charakterisierung der siRNA-vermittelten target RNA-Spaltung durch hAgo2
Phase bei der Assoziation des ternären Komplexes (k -3, binär = 0,0066 s -1 ; k 3, ternär = 0,0048 s -1 ).
Wenn die dritte Phase bei der Bildung binärer Komplexe tatsächlich die Verankerung des 3'-
Endes des guide Stranges repräsentiert, so beschreibt die dritte Phase bei der Bildung ternärer
Komplexe die umgekehrte Reaktion. Die gute Übereinstimmung der beiden Ratenkonstanten
macht dies zu einer plausiblen Annahme. Die einhergehenden konformationellen Änderungen
führen aller Wahrscheinlichkeit nach dazu, dass ein katalytisch kompetenter Komplex gebildet
wird.
6.3.3 hAgo2 besitzt siRNA-Strangtrennungs- und target
RNA-Spaltungsaktivität
Der zentrale Prozess bei der siRNA-vermittelten RNAi ist die sequenzspezische Spaltung
der target RNA an der kanonischen Position gegenüber dem Phosphatrückgrat zwischen dem
10. und 11. Nukleotid des guide Stranges [31]. Diese als slicing bezeichnete Reaktion unterscheidet
den siRNA- vom miRNA vermittelten Weg. In menschlichen Zellen ist allein hAgo2
in der Lage, die Phosphodiesterhydrolyse durchzuführen, da die anderen hAgo Proteine 1, 3
und 4 keine Spaltungsaktivität besitzen [35]. Die Kinetik dieser Reaktion wurde im Rahmen
dieser Arbeit detailliert untersucht. Dazu wurden hAgo2-Konstrukte verwendet, die am N-
bzw. C-Terminus mit verschiedenen Markierungen versehen waren (siehe Abbildung 5.1). Alle
Konstrukte wiesen einen target RNA-Umsatz mit ähnlicher Geschwindigkeitsratenkonstante
der Gesamtreaktion auf (k gesamt, NHA-hAgo2 = 0,0003 s -1 , k gesamt, GST-hAgo2 = 0,0004 s -1 und
k gesamt, hAgo2-His = 0,0002 s -1 ; siehe Abbildung 5.12). Jedoch wurden gravierende Unterschiede
den maximalen Umsatz betreend in Abhängigkeit der Position der Markierung deutlich. Die
beiden N-terminal modizierten Konstrukte GST-hAgo2 und NHA-hAgo2 zeigten mit 91,9 %
bzw. 83,5 % maximalem Umsatz eine hohe enzymatische Aktivität. Das C-terminal modizierte
Fusionsprotein hAgo2-His erzielte hingegen nur einen maximalen Umsatz von 12 %. Die
verminderte Spaltungsaktivität lässt sich durch die Betrachtung struktureller Informationen
durch das T. thermophilus Ago im Komplex mit einer guide DNA erklären. In diesem Protein
wird die C-terminale Aminosäure, Valin685, für die Koordinierung eines Mg 2+ -Ions benötigt,
welches wiederum mit der Phosphatgruppe des 5'-terminalen Nukleotides des guide Stranges
wechselwirkt (siehe Abbildung 2.3.4) [119]. Möglicherweise wird auch bei hAgo2 die letzte
Aminosäure, Alanin859, für diese Positionierung benötigt. Beide Aminosäuren sind klein und
hydrophob. Durch kürzlich veröentlichte strukturelle Studien des die Mid und PIWI Domäne
enhaltenden Lappens des N. crassa QDE-2 konnten Hinweise gewonnen werden, dass
der C-Terminus an der hydrophoben Kontaktäche zwischen den beiden Domänen lokalisiert
ist [130]. Die Einführung zusätzlicher Aminosäuren an dieser Stelle muss die Faltungsgeometrie
von hAgo2 gravierend verändern, was sich in der Abnahme der enzymatischen Aktivität
bemerkbar macht.
183