Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

A Anhang
A.1 Theoretische Grundlagen der biochemischen und
biophysikalischen Methoden
A.1.1 Ermittlung von Dissoziationskonstanten durch Fluoreszenztitration
unter steady state Bedingungen
Die Gleichgewichtsreaktion zweier Bindungspartner A und B kann wie folgt beschrieben werden:
A + B k 1
⇋ AB
(A.1)
k -1
Durch Anwendung des Massenwirkungsgesetzes ergibt sich die Dissoziationskonstante K d :
K d =
[A] · [B]
[AB]
(A.2)
Durch die Massenerhaltung gilt folgender Zusammenhang analog für beide Bindungspartner
A und B:
[A] 0 = [A] + [AB]
(A.3)
mit [A] 0 , [B] 0 = Gesamtkonzentration der Bindungspartner A bzw. B, [A], [B] = Konzentration
der freien Bindungspartner A bzw. B und [AB] = Konzentration des Komplexes aus A und B.
Aus Massenwirkungsgesetz (A.2) und Massenerhaltung (A.3) ergibt sich nun:
K d = ([A] 0 − [AB]) · ([B] 0 − [AB])
[AB]
(A.4)
Durch das Auösen der Gleichung nach [AB] ergeben sich zwei mathematische Lösungen, von
denen jedoch nur diejenige mit dem negativen Vorzeichen vor dem Wurzelterm physikalisch
sinnvoll ist:
[AB] = [A] 0 + [B] 0 + K d
2
√ ([A]0 )
+ [B] 0 + K 2
d
−
− [A] 0 · [B] 0 (A.5)
2
Bei der in dieser Arbeit beschriebenen Fluoreszenztitration unter steady state Bedingungen
kommt es zur Änderung eines Fluoreszenzsignals ∆F, das vom Bindungspartner B mit konstanter
Konzentration ausgeht. Da die Änderung des Signals durch die Wechselwirkung beider
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