Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

Fluoreszenz
cpm
5 Ergebnisse
GST
hAgo2
A
8000
B
16000
7500
12000
7000
8000
6500
4000
6000
0 500 1000 1500
GST-hAgo2 (nM)
0 1000 2000 3000 4000 5000
GST-hAgo2 (nM)
C
NHA
- +
+ +
hAgo2
NHA-hAgo2
P-as2B
gebundene
P-as2B
ungebundene
P-as2B
Abbildung 5.23: Bestimmung der Afnität von hAgo2 zu P-as2B-FAM (siehe Abschnitt 4.4.2). (A)
Gleichgewichts-Fluoreszenztitration von 20 nM P-as2B-FAM mit steigenden Konzentrationen GSThAgo2.
Die Auswertung der Daten erfolgte mit einer quadratischen Bindungsgleichung und ergab
K d = 7,1 (± 2,1) nM. (B) Filterbindungsexperiment von 5 nM P-as2B mit steigenden Konzentrationen
GST-hAgo2. Die Auswertung der Daten erfolgte mit einer quadratischen Bindungsgleichung und ergab
K d = 7,0 (± 0,9) nM. (C) Nicht-denaturierendes 8 % PAA-Gel zur Auftrennung von Ansätzen mit 5 nM
am 5'-Ende radioaktiv markierter P-as2B und 0 nM oder 2500 nM NHA-hAgo2. Die Detektion erfolgte
mittels Autoradiographie. cpm: counts per minute.
5.23 A).
Um auszuschlieÿen, dass die Fluoreszenzmarkierung von P-as2B-FAM einen Einuss auf
die Bindungsreaktion besitzt, wurde ein Komplex aus 20 nM P-as2B-FAM und 600 nM GSThAgo2
mit steigenden Konzentrationen P-as2B titriert, um eine Verdrängung zu erwirken.
Zwar konnte bei hohen Konzentrationen von P-as2B eine Fluoreszenzzunahme verzeichnet
werden, jedoch war die Gesamtsignaländerung zu gering für eine verlässliche mathematische
Auswertung. Deshalb wurde alternativ ein Filterbindungsexperiment zur Bestimmung des
durchgeführt, bei dem die Markierung des Substrates mit einem sperrigen Fluorophor
K d
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