Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

6.5 Modell der minimalen rekombinanten RNA-Interferenz
lierung der Kinase [224] und bindet sie, wodurch ihre wachstumsregulierenden Eigenschaften
beeinusst werden [224226]. TRBP stellt also einen negativen Regulator der PKR dar. Im
Gegensatz dazu hat das zu 42 % sequenzidentische PACT aktivierenden Einuss [232, 233].
Die Arbeitsgruppe um Lee zeigte, dass PACT ebenfalls eine Rolle bei der siRNA-vermittelten
RNAi spielt und mit TRBP, hAgo2 und Dicer interagieren kann. Weiterhin gab diese Arbeit
erste Hinweise darauf, dass sich PACT und TRBP nicht nur bei der Regulation der PKR,
sondern auch bei der RNA-Interferenz eventuell unterschiedlich verhalten könnten [148]. Diese
Annahme ist konsistent mit den präliminären Ergebnissen dieser Arbeit. hPACT-His ist in der
Lage, während der Präinkubationsphase die doppelsträngige siRNA zu binden, übergibt sie
jedoch scheinbar nicht an hAgo2, so dass es nicht ezient programmiert wird und deshalb ein
verminderter target RNA-Umsatz beobachtet wird. Möglicherweise stellt hPACT also einen
negativen Regulator von hAgo2 dar. Andererseits ist auch eine zelluläre Speicherfunktion denkbar,
bei der hPACT mit siRNAs assoziiert und eventuell durch einen unbekannten Stimulus
freisetzt, so dass sie in den RNAi Weg eingeschleust werden können.
6.5 Modell der minimalen rekombinanten RNA-Interferenz
Im Folgenden werden die in Kapitel 6 diskutierten Ergebnisse in einem schematischen Modell
zusammengefasst, das die biologische Relevanz der gewonnenen Daten widerspiegeln soll (siehe
Abbildung 6.2). Auÿerdem sind die wesentlichen Erkenntnisse der minimalen rekombinanten
RNAi übersichtlich und in kurzer Form erläutert.
Beladung von hAgo2 Während des initialen Schrittes kollidiert das rekombinante hAgo2
mit einer guide RNA, woraufhin es zunächst zur Verankerung ihres 5'-Endes in einer Bindetasche
der Mid Domäne kommt. Die 5'-terminale Phosphatgruppe ist für diesen Schritt
von groÿer Bedeutung. Anschlieÿend wird vermutlich das 3'-Ende der guide RNA in einer
Bindetasche der PAZ Domäne gebunden. In einem alternativen Prozess kann an Stelle einer
einzelsträngigen guide RNA auch eine doppelsträngige siRNA auf hAgo2 geladen werden, wie
dies vermutlich innerhalb einer Zelle passiert. Die Bindungsreaktion verläuft analog zu derjenigen
einer guide RNA. Jedoch muss im Unterschied der passenger Strang aus dem Komplex
entlassen werden, um die Erkennung und Bindung einer target RNA zu ermöglichen. Wie dies
vonstatten geht, ist bislang unbekannt. Die Beladung von hAgo2 mit doppelsträngiger siRNA
kann wahrscheinlich durch eine Präinkubation der siRNA mit hTRBP assistiert werden, während
hPACT inhibierend wirkt.
Erkennung und Bindung von target RNA Nach der Bildung eines binären hAgo2/guide
RNA-Komplexes ist dieser bereit für die Erkennung einer target RNA. Zunächst kommt es zur
Bildung eines Kollisionskomplexes und anschlieÿend möglicherweise zu einer sequenzspezischen
Interaktion zwischen guide und target RNA im seed Bereich. Im Anschluss kommt es zu
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