Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

4.3 Methoden im Umgang mit Proteinen
4.3 Methoden im Umgang mit Proteinen
4.3.1 Quantizierung von Proteinen
Für die Bestimmung der Konzentration von Proteinen in Lösung wurden verschiedene Verfahren
verwendet. Die Wahl des Verfahrens hing dabei beispielsweise von der Anzahl der aromatischen
Aminosäuren und somit vom molaren Extinktionskoezienten ab, oder von einer
möglichen Verunreinigung durch Nukleinsäuren. Dabei ist es üblich, dass die mit unterschiedlichen
Methoden ermittelten Werte voneinander abweichen. Aus diesem Grund wird im weiteren
Verlauf dieser Arbeit die Art der Proteinbestimmung mit der entsprechenden Konzentration
angegeben.
Photometrische Konzentrationsbestimmungen
Die Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Absorptionsmessung beruht auf der Tatsache,
dass Proteine bei bestimmten Wellenlängen Licht absorbieren. Die aromatische Aminosäure
Tryptophan besitzt ein Absorptionsmaximum bei 280 nm. Auch Tyrosin und Phenylalanin
absorbieren Licht dieser Wellenlänge. Durch die unterschiedliche Zusammensetzung von
Proteinen besitzt jedes einen charakteristischen molaren Extinktionskoezienten, der anhand
der Aminosäuresequenz mit Hilfe des Programms ProtParam berechnet wurde [249]. Nach
Messung der Absorption bei 280 nm (A 280 ) mit den Spektrophotometern Nanodrop oder
DU-640 und Berechnung des molaren Extinktionskoezienten wurde unter Anwendung des
Lambert-Beer'schen Gesetzes (siehe Abschnitt 4.2.1) die Konzentration berechnet.
Bei Proteinen, die keine oder wenige aromatische Aminosäuren enthalten bzw. die eventuell
mit Nukleinsäuren kontaminiert waren, wurde das Verfahren nach Ehresmann [250] angewendet.
Es wurden die Absorptionen bei 228,5 nm und 234,5 nm gemessen und die Konzentration
wie folgt berechnet:
c = A 228 nm − A 234 nm
3, 1
(4.2)
mit c = Konzentration (mg/ml) und A 228 nm/234 nm = jeweilige Absorption.
Bei Proteinlösungen, die bis zu 20% (w/v) Nukleinsäuren oder Nukleotide enthielten, wurde
die Berechnung nach Warburg [251] eingesetzt. Es wurden die Absorptionen bei 280 nm und
260 nm gemessen und die Konzentration wie folgt berechnet:
c = 1, 55 · A 280 nm − 0, 76 · A 260 nm (4.3)
mit c = Konzentration (mg/ml) und A 280 nm/260 nm = jeweilige Absorption.
Um die Proteinkonzentration weitgehend unabhängig von ihren aromatischen Aminosäuren
zu ermitteln, wurde das Verfahren nach Scopes [252] angewendet. Hierbei wird die Tatsache
genutzt, dass die π-Elektronen der Peptidbindungen im Proteinrückgrat Licht der Wellenlänge
205 nm absorbieren. Da die aromatischen Aminosäuren ebenfalls bei dieser Wellenlänge eine
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