Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

5.8 Charakterisierung der target RNA-Bindung durch den binären hAgo2/guide RNA-Komplex
den seed Bereich [259]. Dabei wird im binären Komplex der guide Strang derart positioniert,
dass die Basen 2 8 optimal zugänglich sind für die target RNA [28]. Dies stellt die Ausgangssituation
der hier gezeigten Experimente zur Erkennung und Bindung der target RNA durch
den binären Komplex dar. Bei perfekter Komplementarität, wie es hier der Fall ist, bilden
guide und target Strang ein Hybrid, das weniger als eine Umdrehung umfasst. Dieser Zustand
wird gut durch einen Komplex aus dem T. thermophilus Ago, einer 21 nt langen guide DNA
und einer 12 nt langen target RNA repräsentiert. In diesem Komplex bleibt das 3'-Ende des
guide Stranges gebunden (siehe Abbildung 2.8 C) [120]. Der Vergleich der Röntgenstruktur
des binären T. thermophilus Ago/guide DNA-Komplexes [28] und des den 12 nt langen target
RNA Strang enthaltenden ternären Komplexes (siehe Abbildung 2.8 B und C) macht deutlich,
dass bei der Bildung dieses ternären Komplexes eine konformationelle Umlagerung von Ago
erfolgt [120]. Hierbei kommt es zur Erweiterung der basischen Bindungsfurche, so dass genug
Raum für die Bindung der target RNA geschaen wird. Die zweite hier beobachtete Phase
repräsentiert möglicherweise diese konformationelle Änderung des ternären Komplexes. Die
zugehörigen Ratenkonstanten wären k 2 = 0,0131 s -1 und k -2 = 0,0024 s -1 .
Wenn über den seed Bereich hinaus eine kritische Anzahl an Basenpaarungen ausgebildet
wird, kommt es zur Freisetzung des 3'-Endes des guide Stranges aus der PAZ Domäne und zur
Hybridisierung von guide und target RNA unter Einnahme einer A-Konformation. Dieser Zustand
wird repräsentiert durch einen ternären Komplex, bei dem T. thermophilus Ago an eine
21 nt lange guide DNA und eine 15 nt lange target RNA gebunden vorliegt (siehe Abbildung 2.8
D) [120]. Auch dieser Prozess ist mit einer konformationellen Änderung verbunden. Es kommt
vornehmlich zu einer Rotation der PAZ Domäne sowie einer positionellen Verschiebung der
Bereiche L1 und L2 der PIWI Domäne. Die dritte Phase könnte dieser konformationellen
Umlagerung entsprechen. Diese Annahme wird durch die Tatsache gestützt, dass die dritte
Phase bei der Dissoziation des binären Komplexes eine sehr ähnliche Ratenkonstante aufweist
wie die dritte Phase bei der Assoziation des ternären Komplexes (k -3, binär = 0,0066 s -1 ;
k 3, ternär = 0,0048 s -1 ). Es besteht also die Möglichkeit, dass zunächst die Verankerung des 3'-
Endes des guide Stranges in der PAZ Domäne erfolgen muss. Als Gründe wären eine erhöhte
Stabilität des binären Komplexes, besserer Schutz vor Exonukleasen in der Zelle oder ein molekularer
Schalter während der target RNA-Erkennung denkbar. Sobald über eine perfekte
Komplementarität des seed Bereiches die gebundene RNA als spaltbares target für den binären
Komplex identiziert wurde, kommt es zur Freisetzung des guide Stranges aus der PAZ
Domäne. Die einhergehenden konformationellen Änderungen führen aller Wahrscheinlichkeit
nach dazu, dass ein katalytisch kompetenter Komplex gebildet wird. Das hier beschriebene
kinetische Modell der target RNA-Erkennung und -Bindung ist daher sehr konsistent mit den
strukturellen Daten der prokaryonten Argonaute Proteine.
Ausgehend von den Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten konnte unter Verwendung
von Gleichung 5.1 die Dissoziationskonstante berechnet werden. Sie beträgt 0,09 nM
143