Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

Fluoreszenz
5 Ergebnisse
Bestimmung der Anität zu dsRNA
Für den Vergleich der Anitäten von hAgo2 für einzel- bzw. doppelsträngige siRNA wurde
als nächstes die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante für P-si2B (siehe Abbildung 5.22
C) bestimmt. Bei dieser Fluoreszenztitration war die Änderung des Signals mit etwa 23 %
schwächer als bei den beiden einzelsträngigen Substraten. Die Auswertung der Daten mittels
quadratischer Bindungsgleichung ergab K d = 47,9 (± 7,5) nM (siehe Abbildung 5.25).
GST
hAgo2
15000
14000
13000
12000
11000
0 500 1000 1500
GST-hAgo2 (nM)
Abbildung 5.25: Bestimmung der Anität von hAgo2 zu P-si2B-FAM (siehe Abschnitt 4.4.2).
Gleichgewichts-Fluoreszenztitration von 20 nM P-si2B-FAM mit steigenden Konzentrationen GSThAgo2.
Die Auswertung der Daten erfolgte mit einer quadratischen Bindungsgleichung und ergab
K d = 47,9 (± 7,5) nM.
5.7.3 Kinetik der Bindungsreaktion von hAgo2 und verschiedenen
siRNA-Substraten
Mittels Gleichgewichts-Fluoreszenztitration konnte die Bildung von Komplexen aus hAgo2
sowie allen drei in Abbildung 5.22 dargestellten siRNAs beobachtet werden. Hierbei war vor
allem die relativ hohe Anität zur doppelsträngigen P-si2B-FAM überraschend. Im Folgenden
wurde die Bildung dieser Komplexe in Abhängigkeit der Zeit unter pre-steady state Bedingungen
im Detail untersucht. Dabei wurden Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten mit
Hilfe der stopped ow Technik bestimmt (siehe Abschnitt 4.4.3). Mit Hilfe dieser Methode
können Reaktionsphasen determiniert werden, die sich in ihrer Ratenkonstante unterscheiden.
Dadurch kann ermittelt werden, aus wie vielen Phasen eine Bindungsreaktion mindestens besteht
sowie ihre Geschwindigkeit gemessen werden. Die kinetischen Messungen wurden mit
NHA-hAgo2 durchgeführt.
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